多探針熒光原位雜交技術(shù)在膀胱尿路上皮癌診斷中的意義

王 芳，田宏偉，丁 輝，祁媚嬌

多探針熒光原位雜交技術(shù)在膀胱尿路上皮癌診斷中的意義

王 芳1，田宏偉2，丁 輝3，祁媚嬌3

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.甘肅省人民醫(yī)院；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，甘肅蘭州730000）

目的探討多探針熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）在膀胱尿路上皮癌診斷的可行性，并探討其與腫瘤臨床分期和病理分級(jí)的關(guān)系。方法收集經(jīng)膀胱鏡檢查診斷為膀胱移行細(xì)胞癌35例患者，及10例非腫瘤病人，10例正常人群的新鮮尿液標(biāo)本，應(yīng)用FISH檢測(cè)膀胱尿路上皮癌患者尿液脫落細(xì)胞中的3、7、17、9號(hào)染色體異常，并進(jìn)行尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（Urinary cytological examination，UCE）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析FISH和UCE診斷膀胱癌的靈敏性和特異性，并分析FISH檢測(cè)染色體突變與膀胱腫瘤分期及分級(jí)的相關(guān)性。結(jié)果多探針聯(lián)合FISH技術(shù)與UCE診斷膀胱癌的靈敏度分別為82.86%和37.14%（P＜0.05），特異度分別為95.0%和100%（P＞0.05）。3、7及17號(hào)染色體著絲粒特異性探針及9號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶（9p21）的p16位點(diǎn)特異性探針聯(lián)合應(yīng)用診斷膀胱癌的靈敏度為82.86%，而單一探針診斷膀胱癌的靈敏度最高僅為65.71%。膀胱癌患者中發(fā)生3、7、17號(hào)染色體畸變及9號(hào)染色體p16基因畸變均與不同病理分級(jí)（G1－G3）有關(guān)（P＜0.05）；3、7號(hào)染色體畸變與臨床分期（T0－T4）有相關(guān)性（P＜0.05），而17號(hào)染色體及9號(hào)染色體p16基因畸變與臨床分期無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論多熒光探針FISH診斷膀胱尿路上皮癌敏感性高、特異性強(qiáng)、無(wú)創(chuàng)，且與腫瘤分期和分級(jí)有一定相關(guān)性，臨床應(yīng)用價(jià)值高。

膀胱癌；熒光原位雜交技術(shù)；染色體變異；尿脫落細(xì)胞學(xué)；分子細(xì)胞遺傳學(xué)

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1957）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)較常見(jiàn)的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第九位，在男性排名第六位，女性排在第十位左右。尿脫落細(xì)胞學(xué)和膀胱鏡檢查是當(dāng)前臨床中診斷膀胱癌最常用的方法，其中尿脫落細(xì)胞學(xué)（Urinary cytological examination，UCE）檢查特異性較高，且為無(wú)創(chuàng)性檢查，但其敏感性較低，尤其對(duì)于分期及分級(jí)較低的腫瘤。膀胱鏡檢查的優(yōu)點(diǎn)是敏感性較高，但缺點(diǎn)是對(duì)尚無(wú)突出粘膜表面的早期癌診斷的敏感較低，而且是有創(chuàng)性的。

研究報(bào)道在膀胱癌中，一些染色體會(huì)發(fā)生非隨機(jī)性的改變，包括結(jié)構(gòu)畸變和染色體數(shù)目異常。常見(jiàn)結(jié)構(gòu)畸變的染色體有1、3、5、9、11、17、21，數(shù)目異常的染色體有1、3、7、8、9、10、11、15、17、Y［1］。其中3號(hào)染色體的單體性、7號(hào)染色體的三體性、17號(hào)染色體的多體性、9q21P16基因的雜合性缺失與膀胱癌的發(fā)生及復(fù)發(fā)有顯著的關(guān)系，而且在膀胱癌中這幾種染色體同時(shí)出現(xiàn)異常的比例較高。熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是一種無(wú)創(chuàng)的特異性檢測(cè)尿脫落細(xì)胞中染色體異常的技術(shù)，近些年受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注［2－5］。本研究選用針對(duì)3、7、9、17號(hào)染色體的特異性探針，對(duì)膀胱癌、非膀胱癌患者和正常人尿液的脫落細(xì)胞進(jìn)行FISH檢測(cè)，并與尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)結(jié)合臨床分期及病理分級(jí)，以探討多探針FISH技術(shù)在膀胱癌診斷及監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1臨床患者資料

收集蘭州大學(xué)第二醫(yī)院及甘肅省人民醫(yī)院泌尿外科35例膀胱癌住院患者的新鮮尿液，其中男22例，女13例，年齡26－88歲，中位年齡60歲。所有病例均經(jīng)膀胱鏡檢查診斷為膀胱移行細(xì)胞癌。腫瘤的臨床病理情況（膀胱腫瘤2002TNM分期系統(tǒng)和WHO 1973分級(jí)法）：T0－T18例，T212例，T310例，T45例；G114例，G210例，G311例。另設(shè)對(duì)照組20例（包括泌尿系統(tǒng)良性疾病10例，正常人群10例），以建立染色體的畸變閾值并制定陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。所有人組的病例均簽署知情同意書(shū)，通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要儀器和試劑

采用美國(guó)UroVysionTM Bladder Cancer Kit（GLP P16／CEPl7／CEP3／CEP7DNA探針），其中CEP3、CEP7、CEP17三個(gè)DNA探針?lè)謩e覆蓋3、7、17號(hào)染色體的著絲粒區(qū)域，CLP P16探針覆蓋人類(lèi)9號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶（9p21）的P16基因。3號(hào)CEP為紅色熒光信號(hào)，7號(hào)CEP為綠色熒光信號(hào)，17號(hào)CEP為藍(lán)色熒光信號(hào)，雜交到9號(hào)染色體長(zhǎng)臂（9p21）的P16探針為金色熒光信號(hào)。主要儀器有熒光顯微鏡（Olympus IX81），電熱恒溫水浴槽、離心機(jī)和干燥箱等。RNaseA溶液和胃蛋白酶溶液購(gòu)自Transgene公司。

1.3標(biāo)本采集與處理

患者均在膀胱鏡檢查前行尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查和FISH檢測(cè)。連續(xù)3d留取患者晨尿200ml，1h內(nèi)送檢。每份尿樣分為2份，分別進(jìn)行尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查和FISH檢測(cè)，并將其檢測(cè)結(jié)果與最終的膀胱鏡病理檢查結(jié)果比較。將收集到的尿液離心10 min（2 000r／min），棄上清，用37℃水浴預(yù)熱的膠原酶B（0.5mg／ml）重懸沉淀，并置于37℃水浴中消化20min，離心棄上清，再用KCl（0.075mol／L）重懸沉淀，置于37℃水浴中20min，再加入2ml固定液顛倒混勻后離心，棄上清，再加入固定液重懸沉淀，于室溫中靜置10min，離心棄上清，重復(fù)固定1次，滴片。玻片在56℃老化30min后置入RNA酶溶液（100μg／mL）30min，再放入胃蛋白酶鹽酸溶液中10min，用2×SSC溶液室溫洗滌2次，每次5min，梯度乙醇脫水，準(zhǔn)備變性雜交。

1.4原位雜交及信號(hào)觀察

將70%甲酰胺與2×SSC溶液混合，置于75℃水浴中預(yù)熱，然后將玻片置入該溶液中變性10 min，再立即置入預(yù)冷至－20℃的75%乙醇中，用梯度乙醇脫水后，晾干備用。將探針置于75℃水浴中變性7min，再置于48℃中備用。晾干的玻片在48℃中預(yù)熱5min，然后將10ml探針混合液滴于原有脫落細(xì)胞滴片處，立即加蓋蓋玻片，并用封口膜包被，置于43℃濕盒雜交過(guò)夜。拆除封口膜，去掉蓋玻片，用預(yù)熱至48℃的50%甲酰胺與2×SSC混合溶液洗滌3次，每次5min，再用2×SSC溶液洗滌10min，用0.1%NP－40細(xì)胞裂解液與2×SSC混合溶液洗滌5min，置于暗處晾干后，滴加15μl DAPI熒光染料后封片20min，置于暗處，待觀察。每例分析100個(gè)間期細(xì)胞核，細(xì)胞重疊、破損者不計(jì)數(shù)，微弱雜交信號(hào)不計(jì)數(shù)，細(xì)胞內(nèi)雜交信號(hào)間距小于信號(hào)點(diǎn)直徑2倍者記為1個(gè)信號(hào)點(diǎn)。觀察細(xì)胞信號(hào)點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)樣本中信號(hào)點(diǎn)異常的細(xì)胞比例。

1.5尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查

將受檢患者的尿液標(biāo)本離心后取脫落細(xì)胞制成病理涂片，用顯微鏡進(jìn)行觀察，每例患者連續(xù)留取3 d尿液標(biāo)本做脫落細(xì)胞學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)1次癌細(xì)胞即可判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1閾值的建立

20例正常人尿液，采用以上方法步驟制備玻片及進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行閾值測(cè)定。閾值是指染色體在正常人發(fā)生畸變的最低值，是用于判斷染色體畸變的臨界值，閾值＝異常信號(hào)點(diǎn)細(xì)胞數(shù)目平均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2膀胱癌患者尿液的FISH檢測(cè)結(jié)果

表1 用20例正常人尿液建立FISH閾值

在正常人和非尿路上皮癌患者中，F(xiàn)ISH結(jié)果顯示各探針表現(xiàn)為2紅、2綠、2藍(lán)、2金的4色雜交信號(hào)（圖1A）。在尿路上皮癌患者中，F(xiàn)ISH結(jié)果可見(jiàn)不同程度的染色體數(shù)目異常（圖1B，C，D）。3、7、17號(hào)染色體畸變表現(xiàn)為多倍體，如三體、四體或多體；9號(hào)染色體畸變表現(xiàn)為缺失、單體或者多體。

圖1 膀胱癌患者尿液的FISH檢測(cè)結(jié)果。紅色為CEP3，綠色為CEP7，黃色為9號(hào)染色體GLP P16探針，藍(lán)色為CEP17探針。A，正常。B，C，D均為異常。

2.3尿脫落細(xì)胞學(xué)和FISH檢測(cè)結(jié)果的比較

35例膀胱癌患者中，F(xiàn)ISH陽(yáng)性29例，尿細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性13例。FISH和尿細(xì)胞學(xué)診斷膀胱癌的總敏感性分別為82.86%和37.14%。20例非膀胱癌對(duì)照組中19例FISH檢測(cè)陰性，特異性95%，尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查均為陰性，特異性100%，表2。FISH檢測(cè)診斷膀胱癌的靈敏度明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查（P＜0.01），而兩者特異度相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4多探針FISH和單一探針FISH檢測(cè)結(jié)果比較

為了比較多探針FISH和單一探針FISH檢測(cè)膀胱癌的靈敏度，我們分別用聯(lián)合探針和四種單一的探針進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明膀胱癌患者中發(fā)生3、7、9號(hào)染色體P16基因及17號(hào)染色體的畸變率分別為62.86%、51.43%、54.29%和65.71%，均明顯低于聯(lián)合法檢測(cè)的陽(yáng)性率（82.86%）（表3），說(shuō)明四種探針聯(lián)合應(yīng)用可明顯提高膀胱癌的檢出率。

表2 尿脫落細(xì)胞學(xué)和FISH檢測(cè)診斷膀胱癌的比較

表3 FISH結(jié)果與膀胱癌病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)系

2.5FISH結(jié)果與膀胱癌病例分級(jí)、分期的關(guān)系

為了研究膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞間期核3、7、9、17號(hào)染色體的畸變率是否與不同病理分級(jí)（G1－G3）及臨床分期（T0－T4）有關(guān)，我們分別用聯(lián)合探針及四種探針單獨(dú)檢測(cè)了不同病理分級(jí)及臨床分期膀胱癌患者的染色體畸變率。四種探針聯(lián)合FISH的靈敏度在膀胱癌病理分級(jí)G1、G2、G3分別為42.86%，80%，100%，在臨床分期T0－T1，T2－T4分別為62.50%、88.89%，且病理分級(jí)和臨床分期越高，染色體畸變的陽(yáng)性率越高（表3）。我們將三個(gè)不同病理分級(jí)（G1，G2，G3）的CEP3檢測(cè)的陽(yáng)性率進(jìn)行比較，用SPSS15.0進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，得卡方值為8.344，P＝0.015，P＜0.05，故認(rèn)為三個(gè)病理分級(jí)的CEP3陽(yáng)性率的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明3號(hào)染色體的畸變與膀胱癌的不同病理分級(jí)（G1－G3）有關(guān)，且病理分級(jí)越高，3號(hào)染色體畸變的陽(yáng)性率越高（表3）。用同樣的方法，將三個(gè)不同病理分級(jí)（G1，G2，G3）的CEP7、GLP P16及CEP17檢測(cè)的陽(yáng)性率進(jìn)行比較，結(jié)果表明卡方值分別為9.405，6.233及11.413，P值均小于0.05（表3），說(shuō)明3、7、17號(hào)染色體畸變及9號(hào)染色體p16基因畸變率均與膀胱癌的不同病理分級(jí)（G1－G3）有關(guān)（P＜0.05）。

另外，我們還將不同臨床分期（T0－T1，T2－T4）分別與四種探針的陽(yáng)性率比較，進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果表明3、7號(hào)染色體畸變與臨床分期有相關(guān)性（P＜0.05），而17號(hào)染色體及9號(hào)染色體p16基因畸變與臨床分期無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

熒光原位雜交技術(shù)作為一項(xiàng)常用的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)，主要用于染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變的研究。細(xì)胞遺傳學(xué)的大量研究表明，膀胱癌在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)為某些染色體的畸變。近年來(lái)，膀胱癌的FISH檢測(cè)及其臨床應(yīng)用成為研究熱點(diǎn)［6］。

本研究采用針對(duì)3、7、9、17號(hào)染色體的FISH探針，檢測(cè)并分析膀胱癌的染色體畸變，以探討FISH在國(guó)內(nèi)膀胱癌的臨床應(yīng)用價(jià)值。在本研究中，多探針聯(lián)合FISH診斷與尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷方法的靈敏度分別為82.86%和37.14%（P＜0.05），特異度分別為95.0%和100%（P＞0.05）。另外，多探針聯(lián)合FISH的靈敏度在膀胱癌病理分級(jí)G1、G2、G3分別為42.86%，80%，100%，在臨床分期T0－T1，T2－T4分別為62.50%、88.89%，四種染色體聯(lián)合畸變程度與腫瘤的病理分級(jí)（G1－G3）有相關(guān)性（P＝0.006），與文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)果［7］相符。

3號(hào)染色體的異常在膀胱癌較為常見(jiàn)，約占47.4%，與腫瘤的分級(jí)有一定相關(guān)性，且常與其他染色體的異常并存，因此可作為腫瘤浸潤(rùn)性的預(yù)測(cè)指標(biāo)［8］。7號(hào)染色體的畸變?cè)诎螂装┌l(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其多倍性的發(fā)生率大約為13.0%－76.2%，且其多倍體的倍數(shù)與膀胱腫瘤的病理分期、臨床分級(jí)密切相關(guān)，在復(fù)發(fā)性和浸潤(rùn)性膀胱癌中該染色體的三倍體發(fā)生率較高［9］。另外，有研究報(bào)道17號(hào)染色體的異倍體是膀胱癌進(jìn)展和侵襲的標(biāo)志之一，且其異倍體與腫瘤的分期、分級(jí)密切相關(guān)［10］。在膀胱腫瘤中較常見(jiàn)的染色體變化還有9號(hào)染色體的部分或全部丟失，且其與腫瘤的早期發(fā)生密切相關(guān)，國(guó)外研究報(bào)道膀胱癌患者9號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶的純合性缺失率高達(dá)83%［11－12］。在本研究中，膀胱癌患者中發(fā)生3、7、9號(hào)染色體P16基因及17號(hào)染色體的畸變率分別為62.86%、51.43%、54.29%和65.71%，并發(fā)現(xiàn)與病理分級(jí)（G1－G3）有明顯相關(guān)（P＜0.05）；9號(hào)染色體P16基因突變中10例（10／19）表現(xiàn)為不全缺失或完全缺失，有9例（9／19）表現(xiàn)為多倍體；3、7號(hào)染色體畸變與臨床分期（T0－T4）有相關(guān)性（P＜0.05），而17號(hào)染色體及9號(hào)染色體p16基因畸變與臨床分期無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），這一結(jié)果或許與樣本量有關(guān)。

3、7及17號(hào)染色體著絲粒特異性探針及9號(hào)染色體p16位點(diǎn)特異性探針聯(lián)合應(yīng)用診斷膀胱癌的靈敏度為82.86%，而單一探針診斷膀胱癌的靈敏度最高僅為65.71%，故四種探針聯(lián)合應(yīng)用可明顯提高膀胱癌的檢出率。

綜上所述，使用FISH技術(shù)檢測(cè)患者尿液中3、7、9、17號(hào)染色體畸變來(lái)診斷膀胱癌，具有無(wú)創(chuàng)且敏感度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)尿路上皮癌患者有輔助診斷作用，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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The Significance of Multiprobe Fluorescence in Situ Hybridization in Diagnosis of Urary Bladder Cancer

WANG Fang1，TIAN Hong－wei2，DING Hui3，et al.（1.School of Basic Medicine in Lanzhou University；2.Gansu Provincial Hospital；3.Department of Urology in the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou730000，China）

ObjectiveTo evaluate the fasibility of multiprobe fluorescence in situ hybridization（FISH）assay in diagnosing urine bladder cancer，and to discuss the relationship of FISH and clinical stages and pathological grades.MethodsFresh urinary specimen was recruited from 35bladder cancer patients who were diagnosed by biopsies，10non－tumor patients，and 10healthy individuals.Exfoliated cells from fresh urinary specimen was collected and analyzed by FISH using centromeric probes of chromosome 3，7，17and region probe of 9p21.Urinary cytological examination（UCE）was applied at the same time.The sensitivity and specificity of each method in the diagnosis of bladder cancer were determined and various chromosomal aberrations and malignant degree of correlation by comparative analysis.ResultsThe sensitivity of mutiprobe FISH and UCE in diagnosing bladder cancer were 82.86%and 37.14%respectively（P＜0.05），the specificity of mutiprobe FISH and UCE were 95.0%and 100%respectively（P＞0.05）.The sensitivity of combine centromeric probes of chromosome 3，7，17and region probe of 9p21together was 82.86%，while the highest sensitivity using one of them was just 65.71%.The aberration frequency of chromosomes 3，7，17and 9p21were positively associated with the pathological grades（G1－G3）（P＜0.05）.Meanwhile，the abnormality of chromosomes 3and 7 were positively associated with clinical stages（T0－T4）（P＜0.05），however，the aberration frequency of chromosomes 17and 9p21were proved not to be correlated with clinical stages of bladder cancer（P＞0.05）.ConclusionMutiprobe FISH has high value for diagnosing bladder cancer because of its high sensitivity，accurate，non－invasive，and relationship with clinical stages and pathological grades.

Bladder cancer；Fluorescence in situ hybridization；Chromosome aberration；Urinary cytological examination；Molecular cell genetics

R737.14

：A

王芳（1982－），女，博士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事細(xì)胞分子醫(yī)學(xué)方面的研究。

2013－09－14）

1007－4287（2014）12－1957－05

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金自由探索項(xiàng)目（lzujbky－2012－148）；蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目