406例肺癌小活檢標(biāo)本中表皮生長(zhǎng)因子受體基因的突變分析

陳 劍，張 燕，王 華，葉菊香，裴 斐，張 波

406例肺癌小活檢標(biāo)本中表皮生長(zhǎng)因子受體基因的突變分析

陳 劍，張 燕，王 華＊，葉菊香，裴 斐，張 波

（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系／北京大學(xué)第三醫(yī)院病理科，北京100191）

目的探討肺癌小活檢標(biāo)本中表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因的突變情況。方法采用蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（Scorpions ARMS）檢測(cè)406例肺癌小活檢標(biāo)本中EGFR基因第18、19、20和21外顯子的突變情況。結(jié)果在406例肺癌小活檢標(biāo)本中，檢測(cè)到190例存在EGFR突變（占46.8%），其中80例為第19外顯子框內(nèi)多核苷酸缺失、88例為第21外顯子L858R突變、4例為第21外顯子L861Q突變、9例為第18外顯子G719X突變、2例為第20外顯子S768I突變、1例為第20外顯子T790M突變；此外，發(fā)現(xiàn)6例存在雙位點(diǎn)突變。肺腺癌EGFR突變率為55.5%（186／335），鱗狀細(xì)胞癌突變率為5.8%（3／52），5例腺鱗癌中有1例檢測(cè)到EGFR基因突變，其它類型肺癌均未檢測(cè)到EGFR基因突變（0／14）。女性患者EGFR基因突變率（62.4%）明顯高于男性患者（32.1%，P＜0.01），非吸煙患者EGFR基因突變率（59.8%）明顯高于吸煙患者（24.7%，P＜0.01）。結(jié)論EGFR基因突變多見于女性、非吸煙和肺腺癌患者；Scorpions ARMS是檢測(cè)活檢小標(biāo)本EGFR基因突變的可靠方法。

肺腫瘤；表皮生長(zhǎng)因子；受體；基因突變；小活檢標(biāo)本

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1944）

目前，肺癌的發(fā)病率和死亡率仍然高居榜首，分子靶向治療開始成為部分肺癌患者重要的治療手段［1］；其中，針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變而設(shè)計(jì)的酪氨酸激酶抑制劑（TKI）已開始在臨床應(yīng)用［2］。及時(shí)為臨床提供腫瘤組織EGFR基因突變狀況以指導(dǎo)靶向治療成為當(dāng)前肺癌分子檢測(cè)的重要任務(wù)［3］；但是約70－85%的新發(fā)肺癌是無法進(jìn)行手術(shù)切除的晚期病例，這就意味著只能用穿刺組織或細(xì)胞學(xué)等小活檢標(biāo)本進(jìn)行診斷或做進(jìn)一步檢測(cè)。對(duì)于腫瘤細(xì)胞較少的標(biāo)本來說，需要選擇靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)方法。我們運(yùn)用蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（scorpions amplification refractory muta－tion system，Scorpions ARMS）檢測(cè)了406例肺癌患者穿刺組織、支氣管鏡活檢組織以及胸水沉渣標(biāo)本中EGFR基因突變情況，并對(duì)如何提高小活檢標(biāo)本基因檢測(cè)的質(zhì)量做了介紹。

1 材料與方法

1.1臨床資料

收集北京大學(xué)第三醫(yī)院2012年6月至2014年2月間確診為原發(fā)性肺癌的小活檢標(biāo)本406例。其中CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺353例、支氣管鏡活檢26例、胸水沉渣標(biāo)本13例、淋巴結(jié)穿刺組織5例、骨穿組織9例。男性209例，女性197例。年齡15歲至84歲，中位年齡63歲。組織學(xué)類型：腺癌335例、鱗狀細(xì)胞癌52例、腺鱗癌5例、大細(xì)胞癌5例、小細(xì)胞癌3例、非小細(xì)胞肺癌（非特指類型）5例、類癌1例。所有標(biāo)本均為治療前獲取，經(jīng)4%中性甲醛固定、石蠟包埋。

1.2DNA抽提

從石蠟包埋組織中切取5－8μm厚切片10片置于1.5ml離心管中，切片時(shí)每例之間用75%酒精將切片刀消毒以防止交叉污染。所有標(biāo)本均同時(shí)切一張HE染色切片，用于判斷組織中腫瘤細(xì)胞含量。采用QIAamp DNA FFPE Tissue（QIAGEN公司）試劑盒提取組織DNA，操作步驟按說明書進(jìn)行。提取的DNA經(jīng)NANODROP超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度。

1.3ARMS法檢測(cè)EGFR基因突變

采用QIAGEN公司的EGFR RGQ PCR檢測(cè)試劑盒。按操作規(guī)程檢測(cè)EGFR基因4個(gè)外顯子中的29種突變；包括第18外顯子中G719X的3種點(diǎn)突變，第19外顯子中的19種缺失突變，第20外顯子中T790M、S7681點(diǎn)突變以及3種插入突變，第21外顯子中L858R、L861Q點(diǎn)突變?？偡磻?yīng)體系為25μl，其中含探針緩沖液19.5μl、Taq酶0.5 μl、模板DNA 5μl。使用QIAGEN公司RGQ PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性30s、60℃退火1min，循環(huán)40次。每批反應(yīng)均同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，通過熒光信號(hào)曲線及閾值線來判讀突變結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率檢驗(yàn)比較不同組別EGFR基因突變情況的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ARMS法檢測(cè)肺癌小活檢標(biāo)本中EGFR基因突變情況

406例肺癌小活檢標(biāo)本中，共檢測(cè)到190例存在EGFR基因突變，突變率為46.8%；其中80例出現(xiàn)第19外顯子框內(nèi)多核苷酸缺失（占所有突變的42.1%，圖1）、88例為第21外顯子L858R突變（46.3%，圖2）、4例為第21外顯子L861Q突變（2.1%）、9例為第18外顯子G719X突變（4.7%）、2例為第20外顯子S768I突變（1.1%）、1例為第20外顯子T790M突變。第19外顯子與第21外顯子單一突變占所有突變的90.5%，而第18外顯子與第20外顯子單一突變占所有突變的6.3%。此外，6例出現(xiàn)雙位點(diǎn)突變，其中3例為第19外顯子缺失和第20外顯子T790M突變（圖3）、3例為第18外顯子G719X和第20外顯子S768I突變。

圖1 第19外顯子框內(nèi)缺失突變

圖2 第21外顯子點(diǎn)突變（L858R）

圖3 第19外顯子缺失和第20外顯子T790M雙位點(diǎn)突變

經(jīng)皮肺穿刺組織353例，檢測(cè)到166例存在EGFR突變，檢出率為47%；支氣管鏡活檢組織26例，檢測(cè)到9例存在EGFR突變，檢出率為34.6%；胸水沉渣組織13例，有8例出現(xiàn)EGFR突變，占61.5%；淋巴結(jié)穿刺組織5例，其中2例檢出EGFR突變（40%）；骨穿組織9例，有5例檢出EGFR突變（55.6%）。

2.2EGFR基因突變與肺癌臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性（表1）

本組病例EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果顯示女性患者EGFR基因突變率為62.4%（123／197），明顯高于男性患者（32.1%，67／209）；非吸煙患者EGFR基因突變率（59.8%，153／256）明顯高于吸煙患者（24.7%，37／150），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織學(xué)類型中，335例肺腺癌中檢測(cè)到EGFR突變的有186例、占55.5%，52例鱗狀細(xì)胞癌中EGFR突變者3例、占5.8%，5例腺鱗癌中有1例檢測(cè)到EGFR基因突變，其它類型肺癌均未檢測(cè)到EGFR基因突變（0／14）。腺癌患者EGFR基因突變率明顯高于單純鱗狀細(xì)胞癌和其它類型肺癌（P＜0.01）。EGFR基因突變與患者年齡無明顯相關(guān)性。

表1 EGFR基因突變情況與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系［例數(shù)（%）］

3 討論

肺癌的分子靶向治療已逐漸為大家所熟知；小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI）對(duì)于有EGFR基因突變的肺癌患者具有較高的客觀緩解率和生存質(zhì)量［4］。因此，國(guó)內(nèi)外有關(guān)臨床指南的診治中已明確指出，部分非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者在作出診斷時(shí)就應(yīng)進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)［5，6］。

人EGFR基因位于第7號(hào)染色體p13－q22區(qū)，全長(zhǎng)200kb，由28個(gè)外顯子組成；編碼1186個(gè)氨基酸，糖蛋白分子量約170kDa。EGFR是一種重要的跨膜受體，具有酪氨酸激酶（TK）活性。人類許多惡性腫瘤如NSCLC、結(jié)直腸癌、頭頸部腫瘤、胰腺癌、乳腺癌等都存在EGFR的突變或異常表達(dá)，所引起的信號(hào)傳導(dǎo)失控與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明：EGFR突變與肺癌病理類型有關(guān)，在腺癌患者中突變發(fā)生率相對(duì)較高；最常見的是EGFR第19外顯子缺失和第21外顯子點(diǎn)突變（約占85%－90%），第18、20外顯子突變率約占10%［7，8］。EGFR基因突變的NSCLC患者，應(yīng)用小分子酪氨酸激酶抑制劑（Gefitini－吉非替尼，Erlotinib－厄洛替尼）治療的有效率可達(dá)70%－80%。因此，對(duì)于NSCLC標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)能夠很好地指導(dǎo)臨床靶向治療［9］。

CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺或支氣管鏡活檢等技術(shù)，由于微創(chuàng)、操作簡(jiǎn)便、并發(fā)癥少等優(yōu)勢(shì)，已越來越廣泛應(yīng)用于臨床。多數(shù)晚期NSCLC患者難以進(jìn)行手術(shù)治療，肺穿刺活檢是明確診斷的一個(gè)重要手段。因此，能夠用于分子檢測(cè)的標(biāo)本多為小活檢標(biāo)本。與手術(shù)切除標(biāo)本相比，小活檢標(biāo)本中所含腫瘤細(xì)胞比例較低，腫瘤細(xì)胞分布較分散，難以人工富集細(xì)胞。在小活檢標(biāo)本中檢測(cè)基因突變，需要采用更為靈敏精準(zhǔn)的方法。相關(guān)研究顯示，傳統(tǒng)的直接測(cè)序法靈敏度有限，腫瘤組織的突變含量需要達(dá)到20%以上才能被檢出［10］，而以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法為基礎(chǔ)的擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）則具有較高的敏感性和特異性［11］。

蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（Scorpions ARMS）是將ARMS和Scorpions PCR兩種技術(shù)結(jié)合起來的一種新技術(shù)［12］。Scorpions探針由一條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針和一條引物構(gòu)成，探針的5′端和3′端分別標(biāo)記報(bào)告熒光和淬滅熒光，擴(kuò)增過程中發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，兩種熒光信號(hào)分離，即可檢測(cè)到報(bào)告熒光信號(hào)。由于序列特異性引物和探針在同一分子上，因此信號(hào)產(chǎn)生較快，可以檢測(cè)出樣品中含量低至1%的突變基因，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，并且操作流程簡(jiǎn)單、快速，整個(gè)過程無需反復(fù)開蓋，也無產(chǎn)物的后續(xù)處理，可以最大程度地避免擴(kuò)增產(chǎn)物之間的交叉污染和環(huán)境污染。樣品在檢測(cè)的同時(shí)還設(shè)置了陽(yáng)性及陰性對(duì)照，有效地避免了假陽(yáng)性和假陰性，保證了結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性和可靠性，尤其適用于穿刺、細(xì)胞學(xué)等腫瘤細(xì)胞較少的標(biāo)本。

研究表明，女性、非吸煙、腺癌及亞洲人群肺癌患者EGFR的突變率較高［13－15］。我們運(yùn)用Scorpions ARMS檢測(cè)了406例原發(fā)性肺癌患者小活檢標(biāo)本中EGFR基因突變情況，共檢測(cè)到190例中存在EGFR突變，檢出率為46.8%；其中90%以上突變發(fā)生在第19和21外顯子。本組研究還發(fā)現(xiàn)了6例雙位點(diǎn)突變，其中3例為第19外顯子缺失和第20外顯子T790M突變，后者是導(dǎo)致腫瘤對(duì)吉非替尼繼發(fā)耐藥的原因之一。本組病例檢測(cè)結(jié)果也顯示女性患者的EGFR基因突變率高于男性患者；非吸煙患者的EGFR基因突變率為59.8%，高于吸煙患者（24.7%）；肺腺癌EGFR突變率為55.5%，明顯高于鱗狀細(xì)胞癌（5.8%）；其它類型肺癌中未檢測(cè)到EGFR基因突變。說明ARMS法檢測(cè)活檢小標(biāo)本EGFR基因突變具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于臨床部分肺癌的分子靶向治療具有重要指導(dǎo)作用。

由于小活檢標(biāo)本體積小、組織疏松、質(zhì)軟易碎，處理不當(dāng)易使組織收縮、變脆、影響后續(xù)觀察和檢測(cè)；因此，我們對(duì)小活檢標(biāo)本固定、脫水、浸蠟等過程的時(shí)間及所用試劑的濃度進(jìn)行了嚴(yán)格控制。主要控制措施是：①選用4%中性緩沖甲醛固定，固定時(shí)間短于2小時(shí)；②逐級(jí)常溫脫水，在無水乙醇中停置時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則組織變硬變脆；③浸蠟包埋時(shí)溫度不可過高。小活檢標(biāo)本除常規(guī)制備HE切片外，還須進(jìn)行免疫組化染色，能夠用于基因檢測(cè)的組織較少。我們采用了預(yù)留免疫組化和基因檢測(cè)切片（或蠟卷）的方法，即做HE切片時(shí)，對(duì)于臨床懷疑肺癌的小活檢標(biāo)本，我們一并切出6－8張免疫組化白片和8－10張蠟卷作為分子檢測(cè)備用；這樣可以避免二次切片時(shí)，因修塊而導(dǎo)致組織過少；同時(shí)將最后一張白片再染一張HE切片，以評(píng)估腫瘤細(xì)胞的含量和比例，使DNA提取的成功率明顯提高。

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Analysis of epidermal growth factor receptor gene mutations in 406 small biopsy samples of lung cancer

CHEN Jian，ZHANG Yan，WANG Hua，et al.
（Department of Pathology，Peking University Health Science Center／Peking University Third Hospital，Beijing100191，China）

ObjectiveTo investigate the mutations of epidermal growth factor receptor（EGFR）gene in small biopsy samples of lung cancer.MethodsMutations of EGFR gene（exons18，19，20and 21）in small biopsy specimens from 406cases of lung cancer were detected by scorpions amplification refractory mutation system（Scorpions ARMS）.ResultsEGFR gene mutations were identified in 190of 406（46.8%）small biopsy samples of lung cancer.In－frame deletions of exon 19occurred in 80patients and point mutation occurred at codon 858，861（exon 21）in 88and 4patients respectively.Nine patients had mutation at codon 719x（exon18）.Two patients had point mutation occurring at codon 768（exon 20）and one patient had point mutation occurring at codon 790（exon 20）.In addition，six patients had compound mutations.Mutations were present in 55.5%of 335adenocarcinoma and in 5.8%of 52squamous carcinoma.EGFR mutation was found in 1of 5adenosquamous carcinoma.There were no EGFR mutation in other type of lung cancer（0／14）.EGFR mutation rate was higher in female patients and patients without smoking history than male patients and patients with smoking history（P＜0.01，respectively）.ConclusionEGFR mutations were more common in female，nonsmoking patients with adenocarcinoma histology.Scorpions ARMS assay is a reliable，specifical and sensitive method for the detection of EGFR kinase domain mutations in small biopsy samples.

lung neoplasms；epidermal growth factor；receptor；gene mutation；small biopsy samples

R734.2

：A

2014－05－20）

1007－4287（2014）12－1944－04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81272945）

＊通訊作者