熒光原位雜交技術(shù)檢測非小細(xì)胞肺癌EGFR基因狀態(tài)及與VEGF、D2－40、Ki－67表達(dá)相關(guān)性臨床意義研究

韓 影，刁文卓，陳 萍，程 薇

熒光原位雜交技術(shù)檢測非小細(xì)胞肺癌EGFR基因狀態(tài)及與VEGF、D2－40、Ki－67表達(dá)相關(guān)性臨床意義研究

韓 影1，刁文卓2，陳 萍1，程 薇1

（1.吉林市中心醫(yī)院病理科，吉林吉林132011；2.吉林市中心醫(yī)院神經(jīng)外科）

肺癌是嚴(yán)重危害人類生命安全的最常見的惡性腫瘤之一，其中以非小細(xì)胞癌居多，近年來其發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢。雖然近年來在診斷方法和治療手段上有了很大發(fā)展，但是仍然不能得到滿意的治療效果，尋找有效的治療手段一直是腫瘤學(xué)界研究的方向。近年來出現(xiàn)的新的治療方法，即靶向治療，使個(gè)體化成為可能，明顯提高了腫瘤治療的療效。在肺癌靶向治療中，兩種小分子酪氨酸激酶抑制劑（即Iressa和Tarceva）能特異地抑制具有EGFR基因變異的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）癌細(xì)胞的生長，使病人的預(yù)后能夠得到改善。本研究通過熒光原位雜交技術(shù)對非小細(xì)胞癌EGFR基因狀態(tài)進(jìn)行檢測，同時(shí)通過免疫組化染色檢測VEGF、D2－40、Ki－67的表達(dá)情況，進(jìn)一步對兩者之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，從而為臨床診斷和治療提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料收集我院2008－2012年間病理科診斷為肺非小細(xì)胞癌的存檔蠟塊80例，年齡34－75歲，中位年齡55歲。其中男性45例，女性35例，所有病例均按照國際抗癌聯(lián)盟UIC的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分期，其中鱗癌26例，腺癌54例，以高分化21例、中分化36例和低分化23例進(jìn)行分組，取其中20例癌旁正常組織作為對照組，術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療。

1.2方法

1.2.1 主要試劑EGFR基因擴(kuò)增檢測試劑盒購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。VEGF鼠抗人單克隆抗體、D2－40鼠抗人單克隆抗體、Ki－67鼠抗人單克隆抗體，SP染色試劑盒和DAB試劑均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 主要儀器 熒光顯微鏡，免疫組化配套儀器，石蠟切片機(jī)，電熱恒溫干燥箱，光學(xué)顯微鏡。

1.2.3 EGFR雜交 確診為肺非小細(xì)胞癌的肺組織石蠟包埋樣本，切片厚度2.5μm，固定時(shí)間8－24 h之間，操作流程均按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 免疫組化染色 所有切片均為2.5μm厚連續(xù)切片，取一組行HE染色，再行SP免疫組化法檢測VEGF、D2－40和Ki－67三項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.5 結(jié)果判定 EGFR檢測結(jié)果計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)ratio值，若ratio＜2為陰性結(jié)果，提示該樣本無EGFR基因擴(kuò)增，若ratio值＞2為陽性結(jié)果，提示樣本中EGFR基因發(fā)生擴(kuò)增。采用半定量雙盲法，根據(jù)顯微鏡下免疫組化陽性細(xì)胞染色進(jìn)行評價(jià)，VEGF陽性反應(yīng)為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿呈棕褐色，D2－40陽性反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈棕褐色，Ki－67陽性反應(yīng)為細(xì)胞核呈棕褐色、顆粒狀。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)≥50%為強(qiáng)陽性（＋＋＋），49%－25%為陽性（＋＋），25%－5%為弱陽性（＋），＜5%為陰性（－）。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 所得數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（MEAN±SE），采用Graph Pad Instat5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間用單因素方差分析，兩組間比較采用Student’s t檢驗(yàn)。認(rèn)為P＜0.05差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EGFR在肺非小細(xì)胞癌中的表達(dá)研究表明若ratio值＞2為EGFR陽性，提示樣本中EGFR基因發(fā)生擴(kuò)增。我們的研究結(jié)果為，低分化組的陽性率明顯高于中分化與高分化組（P＜0.01，n＝21－36），但是高分化與中分化之間沒有明顯差異。說明EGFR的陽性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的惡性程度呈正相關(guān)，可以作為腫瘤分化不良的標(biāo)志物，其表達(dá)高的腫瘤細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的增殖能力（表1）。

2.2VEGF在肺非細(xì)胞癌中的表達(dá)VEGF免疫組化陽性反應(yīng)為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿呈棕褐色，我們的結(jié)果顯示高分化組與中分化組和低分化組之間具有明顯差異（P＜0.001，n＝21－36），中分化組與低分化組之間也有很大差異（P＜0.05，n＝21－36）。以上結(jié)果表明VEGF的陽性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的惡性程度呈正相關(guān)，其惡性程度越高陽性率越高（表2）。

2.3D2－40在肺非小細(xì)胞癌中的表達(dá)D2－40陽性反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈棕褐色，我們的結(jié)果顯示在非小細(xì)胞肺癌組織內(nèi)有陽性表達(dá)D2－40在高分化組與中分化組和低分化組之間具有明顯差異（P＜0.001，n＝21－36），但是中分化與低分化組之間沒有差異，說明隨著惡性程度升高D2－40表達(dá)陽性增強(qiáng)（表2）。

2.4Ki－67在肺小細(xì)胞癌中的表達(dá)Ki－67陽性反應(yīng)為細(xì)胞核呈棕褐色、顆粒狀，我們的結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌與癌旁正常肺組織中均有Ki－67增殖抗原表達(dá)。Ki67蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，并且高分化組的陽性率明顯低于中分化和低分化組（P＜0.001，n＝21－36），中分化又低于低分化組（P＜0.05，n＝21－36）（表2）。

2.5EGFR與VEGF、D2－40和Ki－67之間的關(guān)系我們的研究表明VEGF、D2－40和Ki－67在低分化組均高表達(dá)，說明三者隨著腫瘤的惡性度增加而增加，且EGFR與腫瘤的惡性度相關(guān)，說明EGFR與VEGF、D2－40和Ki－67這四者的表達(dá)可能存在某種關(guān)系，可以指導(dǎo)臨床肺非小細(xì)胞癌的診斷和治療。

表1 EGFR在不同病理學(xué)分級中的表達(dá)

表2 肺非小細(xì)胞癌在不同病理學(xué)分級中的表達(dá)

3 討論

隨著科技的發(fā)展，醫(yī)療水平的進(jìn)步，肺癌的治療手段也有了一定的改進(jìn)，但是由于空氣污染、吸煙等多種問題，肺癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。其中非小細(xì)胞型肺癌約占所有肺癌的85%－90%，所以近年非小細(xì)胞肺癌成為研究的焦點(diǎn)，以期找到更為有效的早期臨床診斷方法和治療手段，從而延長患者生命并提高其生活質(zhì)量［1］。

3.1 表皮生長因子受體EGFR是一種受體酪氨酸激酶，原癌基因c－erbB1的表達(dá)產(chǎn)物。EGFR廣泛分布于人體中，對細(xì)胞的增殖分化有重要調(diào)控作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號通路中關(guān)鍵因子的活性或細(xì)胞定位異常，均會引起腫瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的發(fā)生［2］。已經(jīng)有大量研究表明，EGFR基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，其表達(dá)水平的升高可以促進(jìn)細(xì)胞的異型增殖，造成惡性腫瘤的發(fā)生，并且其表達(dá)水平的高低與腫瘤的程度具有相關(guān)性［3］。目前臨床資料表明EGFR抑制劑Erbitux（cetaximab，西妥昔）單抗抗腫瘤藥物可以結(jié)合腫瘤細(xì)胞EGFR位點(diǎn)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖旁路，抑制腫瘤生長并促使其凋亡［4］。本實(shí)驗(yàn)表明EGFR的陽性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的惡性程度呈正相關(guān)，可以作為腫瘤分化不良的標(biāo)志物，其表達(dá)高的腫瘤細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的增殖能力。因此，EGFR可以作為非小細(xì)胞肺癌惡性程度的生物學(xué)指標(biāo)，也可以作為判斷預(yù)后的重要參數(shù)。

3.2 在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，血管的生成起到重要作用，任何種類的腫瘤都需要血液來提供氧氣和營養(yǎng)支持，VEGF在血管的生成過程中起到重要作用，其在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，抗VEGF抗體的應(yīng)用，可以明顯抑制腫瘤的［5］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示VEGF的陽性表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，惡性程度高的低分化腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較高，惡性程度低的中、高分化腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相對較低，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還觀察到，不但腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色染色，新生血管旁也有較強(qiáng)染色，這些現(xiàn)象說明VEGF是一種重要的血管生長因子，說明VEGF在非小細(xì)胞肺癌的腫瘤發(fā)生過程總起到重要作用。

3.3 D2－40首次是作為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物應(yīng)用于腫瘤淋巴管形成的研究，其表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，但是并在血管內(nèi)皮細(xì)胞無表達(dá)，因此其有助于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞源性腫瘤診斷以及判斷其

他腫瘤組織是否發(fā)生淋巴道浸潤和轉(zhuǎn)移，研究表明其密度越高，轉(zhuǎn)移機(jī)會越大，預(yù)后越差［6］。隨著研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)D2－40在多種腫瘤病理中還具有一些重要的診斷價(jià)值。目前發(fā)現(xiàn)98%睪丸精原細(xì)胞瘤彌漫性強(qiáng)陽性表達(dá)D2－40，同時(shí)其在雪旺氏瘤、富于細(xì)胞性神經(jīng)鞘瘤和約75%上皮樣惡性周圍神經(jīng)鞘膜腫瘤中呈彌漫性強(qiáng)陽性表達(dá)，D2－40作為一種免疫試劑可表達(dá)于多種類型細(xì)胞和不同類型腫瘤［7］。本研究結(jié)果顯示D2－40在非小細(xì)胞肺癌組織內(nèi)有陽性表達(dá)，并且隨惡性程度升高表達(dá)陽性增強(qiáng)，這些現(xiàn)象說明D2－40可以作為非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)志物，并且可以作為判斷臨床預(yù)后的參數(shù)之一。

3.4 Ki－67是存在于增殖細(xì)胞核的一種非組蛋白核蛋白，其在除了G0期以外的其余細(xì)胞增殖周期內(nèi)均有表達(dá)，并且在有絲分裂后蛋白含量迅速減少，新型抗體MB－1可以識別G1、S、G2、M期的Ki－67抗原表達(dá)，所以MB－1可以反映細(xì)胞群體增殖活性的客觀指標(biāo)［8］。因此，本研究試圖通過檢測Ki－67在肺癌組織中表達(dá)，判斷其與腫瘤的惡性生物學(xué)特性的相關(guān)性。結(jié)果顯示：非小細(xì)胞肺癌與癌旁正常肺組織中均有Ki－67增殖抗原表達(dá)，Ki67蛋白在腫瘤組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，說明Ki－67增殖抗原能間接反映惡性腫瘤的無限增殖活性。

3.5 本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)EGFR的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的分級有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明EGFR可作為反映非小細(xì)胞肺癌增殖能力的重要指標(biāo)，在促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。有研究顯示VEGF可以將EGFR的刺激導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)增殖，最終形成腫瘤［9］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在低分化的非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中VEGF與EGFR的表達(dá)均明顯升高，在中分化和高分化中兩者的表達(dá)均相對較低，這種一致的表達(dá)水平表明兩者在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)中存在正相關(guān)性，兩者可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在協(xié)同作用，通過這種協(xié)同作用，進(jìn)一步擴(kuò)大兩者對細(xì)胞增殖長生的影響，從而更加促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。這實(shí)驗(yàn)同時(shí)研究了D2－40和Ki－67在非小細(xì)胞肺癌內(nèi)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)他們的表達(dá)水平均與EGFR的表達(dá)一致，即在低分化腫瘤中表達(dá)高，在中、高分化腫瘤中表達(dá)較低，也存在正相關(guān)性，這表明他們可能也與EGFR在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了協(xié)同作用，但這種協(xié)同作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

人的非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，其中EGFR、VEGF、D2－40、Ki－67的表達(dá)起著重要作用，它們都與腫瘤的發(fā)生有著密不可分的關(guān)系，并且它們的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR與VEGF、D2－40、Ki－67的表達(dá)具有相關(guān)性，表明這三者在腫瘤的發(fā)生過程中具有彼此協(xié)同的作用。這四個(gè)指標(biāo)可以作為臨床檢測非小細(xì)胞肺癌的重要標(biāo)志物，可以結(jié)合臨床參數(shù)，指導(dǎo)治療，評價(jià)預(yù)后。同時(shí)控制這四種指標(biāo)在腫瘤中的表達(dá)，也可以作為非小細(xì)胞肺癌臨床治療的新思路。

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2013－12－09）

1007－4287（2014）12－1926－03

吉林市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目（201133146）