東菱迪芙與依達(dá)拉奉聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腦缺血損傷的研究

金美善，朱恩波，胡 媛，趙 野，李香美，姜美子

東菱迪芙與依達(dá)拉奉聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腦缺血損傷的研究

金美善，朱恩波，胡 媛，趙 野，李香美，姜美子＊

（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林延吉133000）

目的探討東菱迪芙與依達(dá)拉奉聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腦缺血損傷的影響。方法成年健康雄性Wistar大鼠100只，采用改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）腦缺血再灌注模型，隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組（正常組）、缺血再灌注組、東菱迪芙治療組、依達(dá)拉奉治療組、聯(lián)合用藥治療組。運(yùn)用組織化學(xué)染色技術(shù)，檢測腦梗死體積；運(yùn)用循環(huán)酶法，檢測Hcy水平；運(yùn)用免疫比濁法，檢測hs－CRP濃度變化。結(jié)果①腦缺血再灌注24h后大鼠腦梗死體積顯示，東菱迪芙組、依達(dá)拉奉組、聯(lián)合用藥組與缺血再灌注組比較，腦梗死體積均縮小，每組間均有顯著性差異（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組與東菱迪芙組、依達(dá)拉奉組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。②Hcy檢測結(jié)果顯示，缺血再灌注組顯著高于正常組（P＜0.05）；東菱迪芙組顯著低于缺血再灌注組（P＜0.05）；依達(dá)拉奉組顯著低于缺血再灌注組（P＜0.05）；東菱迪芙組顯著低于依達(dá)拉奉組（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組顯著低于單藥組（P＜0.05）。③超敏C－反應(yīng)蛋白的測定結(jié)果顯示，缺血再灌注組顯著高于正常組（P＜0.05）；依達(dá)拉奉組顯著低于缺血再灌注組（P＜0.05）；東菱迪芙組顯著低于缺血再灌注組（P＜0.05）；東菱迪芙組顯著低于依達(dá)拉奉組（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組顯著低于單藥組（P＜0.05）。結(jié)論①東菱迪芙與依達(dá)拉奉通過縮小急性期腦梗死的梗死體積，降低Hcy和超敏C－反應(yīng)蛋白水平，可有效減輕腦缺血損傷，均具有腦保護(hù)作用。②東菱迪芙與依達(dá)拉奉聯(lián)合應(yīng)用較單用東菱迪芙治療或依達(dá)拉奉治療其治療效果更為顯著。

東菱迪芙；依達(dá)拉奉；腦梗死體積；同型半胱氨酸；CRP

腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的疾病之一，其高癱瘓率、高病死率的特點(diǎn)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至威脅患者的生命，到目前為止急性期腦梗死治療關(guān)鍵是：早期干預(yù)、預(yù)后措施以及提高康復(fù)率及降低死亡率，應(yīng)找到新的靶點(diǎn)并應(yīng)尋找有效的治療藥物。本實(shí)驗(yàn)通過檢測Hcy、hs－CRP水平的變化及腦梗死體積的變化，探討用東菱迪芙和依達(dá)拉奉對(duì)急性期腦梗死的腦保護(hù)作用及其可能機(jī)制；探討聯(lián)合應(yīng)用東菱迪芙與依達(dá)拉奉對(duì)急性腦缺血損傷的治療效果。

1 材料與方法

1.1材料

健康Wistar大鼠100只，體重200±50g，購自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，東菱迪芙注射液購自北京托畢西藥業(yè)有限公司，依達(dá)拉奉注射液購自吉林省輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司，2%氯化苯四氮唑（TTC）磷酸鹽緩沖液購自北京化學(xué)試劑公司，hs－CRP試劑盒購自德國羅氏診斷有限公司，Hcy試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)的顯微鏡、低溫冰箱、離心機(jī)、顯微外科手術(shù)器械、尼龍線等實(shí)驗(yàn)設(shè)備均有延邊大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1 大鼠腦缺血模型的制作

①麻醉：首先固定大鼠，在腹腔注射10%水合氯醛（4ml／1kg），麻醉起效后可進(jìn)行下一步操作。

②建立大鼠腦缺血再灌注模型：用改良線栓法［1，2］制作大鼠大腦中動(dòng)脈梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。

首先用碘伏消毒術(shù)區(qū)，頸部正中線切口，用剪刀左右剝離頜下腺，在左側(cè)的胸骨舌骨肌、肩胛骨舌骨肌之間分離、暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）及其分支頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA），避開ECA和ICA交接處迷走神經(jīng)、氣管及交感神經(jīng)。頸總動(dòng)脈分叉處底部用手術(shù)線結(jié)扎，為了達(dá)到剝離出頸外動(dòng)脈主干為目的，枕動(dòng)脈和甲狀腺上動(dòng)脈從頸外動(dòng)脈又分出來，此處再次用手術(shù)線結(jié)扎后套出頸內(nèi)動(dòng)脈。解剖顯微鏡下用纖維剪刀在左側(cè)頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈交接處鄰近頸總動(dòng)脈處剪小洞，將尼龍線栓（尼龍線一端涂上一層硅樹脂，使其成為加粗，直徑0.25－0.30mm［1］）線沿小洞口插入至頸內(nèi)動(dòng)脈約18mm左右［3，4］，當(dāng)感覺到阻塞感時(shí)返回約1mm，此時(shí)線前端已通過大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery occlusion reperfusion，MCA）根部，阻塞了左側(cè)MCA血流，最后用手術(shù)線結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，切斷暴露顯示的操作線，各項(xiàng)組織恢復(fù)原位后，縫合皮膚。

建立大鼠缺血再灌注模型半小時(shí)后，大鼠腹腔內(nèi)注射各組藥物按照上述操作方法各組大鼠腹腔內(nèi)注射。

1.2.2 大鼠腦缺血后梗死體積測定 ①腦缺血再灌注24h后，按照上述方法麻醉后將大鼠斷頭取腦。②剝離出腦組織，切片按照冠狀形態(tài)，每次間隔2mm持續(xù)切斷。③將腦組織片放入2%氯化苯四氮唑（TTC）緩沖液中，維持37℃之間，避光染色半小時(shí)。④正常組織染成粉紅色，梗死部位染成白色。⑤測定梗死體積：數(shù)碼相機(jī)拍照保存后，采用LUZEX－F圖像分析軟件測定梗死體積。

1.2.3 猝死大鼠、測定Hcy及hs－CRP 腦缺血24 h后，按照上述方式給予麻醉，麻醉生效后暴露心臟，用5ml注射器取心室血5ml左右，用循環(huán)酶法［5］，采用PPI全自動(dòng)生化分析儀［6］進(jìn)行Hcy檢測，采用免疫比濁法［7］，用全自動(dòng)生化儀［8］測定超敏C－反應(yīng)蛋白指標(biāo)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用t檢驗(yàn)比較，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1梗死體積測定

測定腦缺血再灌注24h后的大鼠腦梗死體積（表1）提示：腦梗死體積在缺血再灌注組顯著大于假手術(shù)組、東菱迪芙治療組、依達(dá)拉奉治療組以及聯(lián)合用藥治療組（P＜0.05），表明東菱迪芙與依達(dá)拉奉兩種藥物均有效縮小梗死體積作用。聯(lián)合應(yīng)用兩者用藥治療組與缺血再灌注組比較也有顯著的差異（P＜0.05）；東菱迪芙治療組和依達(dá)拉奉治療組梗死體積比較也有差異。此結(jié)果表明，應(yīng)用東菱迪芙治療效果優(yōu)于應(yīng)用依達(dá)拉奉治療組；聯(lián)合用藥效果更佳。

表1 Wista大鼠的腦梗死體積測定（mm3）（x—±s）

2.2Wista大鼠的血漿Hcy與血清hs－CRP的測定

大鼠局灶性腦缺血24h后，進(jìn)行Hcy測定結(jié)果（表2）顯示：腦缺血灌注模型組Hcy明顯高于假手術(shù)組；腦缺血灌注模型組的同型半胱氨酸水平高于依達(dá)拉奉治療組；依達(dá)拉奉治療組Hcy水平高于東菱迪芙治療組與聯(lián)合用藥治療組；聯(lián)合用藥治療組Hcy水平低于東菱迪芙組。表明東菱迪芙與依達(dá)拉奉兩種藥物均可以針對(duì)Hcy有降低效果，單用東菱迪芙的效果優(yōu)于依達(dá)拉奉，聯(lián)合用藥效果更佳，各組之間有顯著性差異，P＜0.05，可以認(rèn)定Hcy對(duì)大鼠急性腦缺血損傷是一個(gè)敏感標(biāo)記物。

大鼠腦梗死模型24h后，檢測CRP結(jié)果（表2）顯示：腦缺血再灌注組超敏C－反應(yīng)蛋白明顯高于假手術(shù)組；腦缺血再灌注組超敏C－反應(yīng)蛋白明顯高于依達(dá)拉奉治療組；依達(dá)拉奉治療組超敏C－反應(yīng)蛋白水平高于東菱迪芙治療組與聯(lián)合用藥治療組；東菱迪芙治療組超敏C－反應(yīng)蛋白水平高于聯(lián)合用藥組，各組間有顯著性差異，P＜0.05。根據(jù)上述數(shù)據(jù)，東菱迪芙與依達(dá)拉奉兩種藥物均可能對(duì)超敏C－反應(yīng)蛋白降低效果；單用東菱迪芙的效果優(yōu)于依達(dá)拉奉；聯(lián)合用藥有明顯效果。因此CRP可作為大鼠急性腦梗死的一個(gè)敏感指標(biāo)。

表2 Wista大鼠的Hcy與CRP測定（x—±s）

3 討論

東菱迪芙，原名為東菱克栓酶，是經(jīng)過生物工程提純的絲氨酸蛋白酶單成分制劑，是新型強(qiáng)力溶血栓、改善微循環(huán)的制劑。近年來，應(yīng)用東菱迪芙治療腦梗死已成為安全有效的治療方法。起病后6小時(shí)內(nèi)的治療稱為超早期治療，但臨床上有相當(dāng)一部分患者因?yàn)楦鞣N原因不能在有效的時(shí)間窗內(nèi)得到有效的溶栓治療。目前臨床上，常用尿激酶、重組纖溶酶原激活劑（rt－PA）行溶栓治療，但因容易出現(xiàn)顱內(nèi)出血等嚴(yán)重不良反應(yīng)及治療時(shí)間窗限制了其廣泛應(yīng)用。東菱迪芙治療時(shí)間窗較尿激酶等溶栓藥物的治療時(shí)間窗寬，在急性缺血性腦卒中發(fā)病2日內(nèi)治療仍可取得滿意效果，而且東菱迪芙不良反應(yīng)較少，具有良好的安全性。因此，已成為目前臨床應(yīng)用最多的降纖藥物。其可能藥理機(jī)制為［9，10］：①選擇性作用于纖維蛋白原的Aα鏈末端的精氨酸和甘氨酸之間，使纖維蛋白原分解為纖維蛋白單體，使單體聚合成多聚體，多聚體再分解成纖維蛋白降解產(chǎn)物（FDP），后者被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬清除，從而在不引起血管內(nèi)凝血的前提下降低血漿纖維蛋白原，抑制血栓形成和發(fā)展；②能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放血漿中組織纖溶酶原激活劑（t－PA），促進(jìn)纖維蛋白酶生成，減少纖溶酶抑制物，全面改善纖溶系統(tǒng)功能，達(dá)到溶解血栓的作用；③可降低血粘度，抑制紅細(xì)胞聚集及增強(qiáng)紅細(xì)胞變形能力和血管通透性，使血流加速防止血栓形成；④降低血管阻力，增加腦血流量和氧的利用，改善缺血區(qū)的血供，縮小半暗帶，挽救瀕臨死亡的腦細(xì)胞；⑤清除自由基及使抗脂質(zhì)過氧化，降低缺血再灌注后組織中一氧化氮的含量，從而降低神經(jīng)毒性作用，起到腦保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)急性腦缺血損傷的大腦進(jìn)行梗死體積測定結(jié)果顯示，經(jīng)東菱迪芙治療組的腦梗死體積明顯小于缺血再灌注模型組，且檢測CPR、Hcy水平明顯低于缺血再灌注模型組，表明東菱迪芙可有效縮小梗死體積，可通過降低CRP、Hcy水平對(duì)急性期缺血性腦卒中具有腦保護(hù)作用。

依達(dá)拉奉（edaravone）是一種目前為止新發(fā)現(xiàn)的、強(qiáng)效的抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并伴隨神經(jīng)功能缺損起抑制作用。以往的實(shí)驗(yàn)研究證明［11－13］，其具有以下作用：①自由基清除作用：對(duì)腦缺血周邊部位和缺血再灌注部位的DPPH（1，1－二苯基－2－間硝基本偕腙肼）及－OH有明顯的清除作用，從而發(fā)揮其對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用；②抗缺血作用：在大鼠腦缺血－再灌注模型中，大鼠腦缺血－再灌注10min后立即靜脈給予4mg／kg的依達(dá)拉奉，可阻止缺血誘導(dǎo)的海馬CAI區(qū)神經(jīng)元丟失，有抑制缺血區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)死亡死的作用；③抑制缺血—再灌注所致腦水腫及腦內(nèi)白三烯的合成，抑制腦細(xì)胞由花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝及由15－羥過氧化二十碳四烯酸（15－HPETE）引起的腦細(xì)胞過氧化損傷作用，從而達(dá)到對(duì)腦細(xì)胞的保護(hù)作用。依達(dá)拉奉在腦脊液中的濃度與血漿濃度的比率保持在50%－60%，具有良好的脂溶性.故可以較容易地達(dá)到作用部位而發(fā)揮其抗腦缺血作用。另外，依達(dá)拉奉在治療過程中，幾乎不影響血液流動(dòng)力學(xué)、體溫、呼吸、電解質(zhì)平衡或血糖水平、自主運(yùn)動(dòng)、胃腸運(yùn)動(dòng)等。

東菱迪芙在腦梗死治療中的作用已得到廣泛認(rèn)同，依達(dá)拉奉在初步的臨床應(yīng)用中顯示了良好效果。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組與聯(lián)合用藥組、依達(dá)拉奉治療組、東菱迪芙治療組相比，腦梗死體積顯著縮小，CRP與Hcy水平也明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯然兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用比單用東菱迪芙或依達(dá)拉奉更優(yōu)勢依達(dá)拉奉與東菱迪芙的作用機(jī)制完全不同，可能在治療中療有協(xié)同作用，依達(dá)拉奉與東菱迪芙不會(huì)對(duì)彼此藥理作用產(chǎn)生影響，具有積極的臨床意義。

復(fù)雜的腦缺血再灌注后損傷機(jī)制對(duì)目前人類帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及危險(xiǎn)。大量研究表明，溶栓及介入治療仍給患者及家屬帶來副作用及負(fù)擔(dān)，上述治療的不斷發(fā)展及完善已經(jīng)改善了很多患者生活質(zhì)量。安全、穩(wěn)定是降纖治療臨床應(yīng)用的特點(diǎn)，可間接起溶栓作用，但其針對(duì)明確應(yīng)用于急性腦梗死的早期的溶栓及機(jī)制今后有待于進(jìn)一步探討。故溶栓及降纖治療都是有效的治療急性期腦梗死的關(guān)鍵治療措施。上述治療中致殘率、死亡率仍很高的原因在于對(duì)溶栓及降纖治療對(duì)腦組織缺血后帶來的再灌注損傷，尚未發(fā)現(xiàn)更為的有效的治療方案。未來對(duì)腦缺血治療的研究中的關(guān)鍵及核心，從不同發(fā)病過程中干預(yù)措施，但不可否認(rèn)觀察該病的病理過程，達(dá)到治療腦卒中患者的早期干預(yù)、預(yù)后措施提高康復(fù)率及降低死亡率，找到新的治療靶點(diǎn)并開發(fā)更為有效的治療藥物。

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The effect of Batroxobin combined with Edaravone on the Cerebral Ischemia Injury in Rats

JIN Mei－shan，ZHU En－bo，HU Yuan，et al.（Affiliated Hospital of Yanbian University，Deparment of Neurology，Yanji 133000，China）

ObjectiveDiscssion of Batroxobin and combined use of edaravone on acute cerebral ischemic injury.MethodsModified intraluminal middle cerebral artery occlusion（MCAO）model of cerebral ischemia reperfusion.Healthy adult male Wistar 100rats，were randomly divided into five groups，sham operation group（normal group），batroxobin in treatment group，Edaravone group，Combined treatment group.Using histochemical staining technique，detection of cerebral infarction volume；by enzymatic cycling assay，detection of Hcy levels；by immune turbidimetry，changes of hs－CRP concentration detection.Results①Determination of cerebral ischemia and cerebral infarction in rats after 24 h comparison shows the volume：batroxobin group，edaravone group，combination group and ischemia reperfusion model group，both inhibited the volume of cerebral infarction.There was significant difference among groups（P＜0.05）；there were significant difference between combination group and edaravone group，batroxobin group，（P＜0.05）；②Determination of Hcy：The ischemia reperfusion model group was significantly higher than that in normal group（P＜0.05），batroxobin group was significantly lower than that of ischemia reperfusion model group（P＜0.05），edaravone group was significantly lower than that of the ischemia reperfusion model group（P＜0.05），batroxobin group was significantly lower than that of edaravone group（P＜0.05），combination group was significantly lower than that of single drug group（P＜0.05）；③Determination of high sensitivity C－reactive protein：The ischemia reperfusion model group was significantly higher than that in normal group（P＜0.05），edaravone group was significantly lower than that of the ischemia reperfusion model group（P＜0.05），batroxobin group was significantly lower than that of ischemia reperfusion model group（P＜0.05），batroxobin group was significantly lower than that of edaravone group（P＜0.05），combination group was significantly lower than single drug group（P＜0.05）.ConclusionTobishi batroxobin and edaravone can reduce the volume of acute cerebral infarction，and reducing the Hcy and ultra－sensitivity C－reactive protein levels，which caneffectively reduce cerebral ischemic injury，has protective effect on brain.The treatment of acute cerebral infarction two drugs is only applied in treatment or edaravone Tobishi batroxobin its therapeutic effect is more significant.

Tobishi batroxobin；Edaravone；The volume of cerebral infarction；Homocysteine；hs－CRP（Chin J Lab Diagn，2014，18：1915）

R743

：A

2014－02－18）

＊通訊作者