響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取豆渣水溶性膳食纖維

李甜甜，李保國，郭雯麗，黃海欣

（上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所，上海200093）

膳食纖維作為七大營養(yǎng)素之一，根據(jù)其溶解性可分為不溶性膳食纖維（IDF）和水溶性膳食纖維（SDF），其中水溶性膳食纖維約占膳食纖維總量的2%～3%，主要包含果膠等親水膠體和部分半纖維素，可減少血液中的膽固醇、調(diào)節(jié)血糖水平并降低心臟病風(fēng)險，可有效清除有害物質(zhì)，防治膽結(jié)石以及結(jié)腸癌，在許多方面具有比不溶性膳食纖維更強的生理功能[1-3]。傳統(tǒng)豆渣水溶性膳食纖維提取工藝包括粗分離法，化學(xué)提取法（酸、堿法）。這些方法提取純度不高，不能得到高活性的水溶性膳食纖維且容易造成環(huán)境污染。目前國內(nèi)外普遍采用生物技術(shù)方法（酶法、發(fā)酵法）、物理法（機械降解處理法）提取高活性的膳食纖維[4]。

微波加熱能夠透射到生物組織內(nèi)部偶極分子和蛋白質(zhì)的極性側(cè)鏈以極高的頻率振蕩，引起分子的電磁振蕩等作用，增加分子的運動，導(dǎo)致熱量的產(chǎn)生。微波輻射過程是高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)到達物料內(nèi)部的微管束和腺胞系統(tǒng)的過程。由于吸收了微波能，細胞內(nèi)部的壓力超過了細胞壁膨脹所能承受的能力，結(jié)果細胞破裂，其內(nèi)的有效成分自有留出。細胞破碎后，可以用乙醇沉降水溶性膳食纖維，從而提高膳食纖維的提取率[6-7]。近年來，微波技術(shù)廣泛用于食品工業(yè)，具有選擇性強、操作時間短等特點，本文將在高壓預(yù)處理基礎(chǔ)上，采取微波輔助酶法提取豆渣水溶性膳食纖維。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豆渣：上海清美綠色食品有限公司提供；95%乙醇（分析純）、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；復(fù)合纖維素酶：杰諾生物酶有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海市實驗儀器總廠；高速粉碎機：北京燕山正德機械設(shè)備有限公司；MM721NG1-PW微波爐：美的電器有限公司；TDZ4-WS離心機：上海盧湘儀有限公司；JJ-500精密電子天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；pHS-25型數(shù)顯pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋HH-6：蘇州威爾實驗用品有限公司；Avanti J-20XP高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝

樣品干燥粉碎→蛋白酶→滅酶→加壓→微波，復(fù)合纖維素酶→水浴酶解→滅酶→濃縮→離心過濾→醇提→離心過濾→SDF

1.3.2 豆渣水溶性膳食纖維含量的測定

取2 g豆渣樣品，加水50 mL，在高壓滅菌鍋中進行加壓預(yù)處理3.5 h，在60℃下恒溫水??；加纖維素酶在一定pH的緩沖液中微波輔助酶解；合并提取上清液并在8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，加入4倍體積的95%乙醇對濾液進行沉淀，離心收集醇提取物，真空干燥箱干燥至質(zhì)量恒定即得到SDF產(chǎn)品。

豆渣水溶性膳食纖維產(chǎn)率=（提取的膳食纖維質(zhì)量/豆渣質(zhì)量）×100%

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 單因素試驗

選酶添加量、酶解時間、微波功率、pH等因素，在溫度為50℃下進行膳食纖維制備單因素實驗。

1.4.2 響應(yīng)面試驗

依據(jù)單因素實驗結(jié)果，進行響應(yīng)面法Box-Behnken Design實驗設(shè)計。以微波功率、酶解時間、pH、加酶量為獨立變量（A、B、C、D），以 SDF 得率為響應(yīng)值，實驗因素水平設(shè)計見表1。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert.V8.0.5對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析并繪制響應(yīng)曲面。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels for Box-Behnken experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 微波功率、酶解時間對提取SDF得率的影響

選取不同的微波功率提取提取SDF，結(jié)果如圖1所示。

圖1 微波功率與SDF得率的關(guān)系Fig.1 Relation of microwave power and SDF extraction rate

由圖1可以看出，隨著微波功率的逐漸升高，微波輔助酶法提取SDF得率呈增長趨勢。當(dāng)微波功率超過500 W后，微波輔助酶法提取SDF得率反而下降。這可能是因為微波功率過高，影響了纖維素酶活性。因此微波輔助酶法提取SDF微波功率應(yīng)控制在500 W左右最為適宜。

分別在不同酶解時間考察提取SDF的得率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解時間與SDF得率的關(guān)系Fig.2 Relation of enzymatic hydrolysis time and SDF extraction rate

在設(shè)定時間0.5 h～3 h范圍內(nèi)，隨著酶解時間的延長，超聲波輔助酶法提取SDF得率呈上升趨勢（圖2）。分析認為提取0.5 h～1.5 h，由于酶解時間過短，微波輔助酶法提取SDF沒有完全被提取，因此微波輔助酶法提取SDF得率變化不明顯；提取1.5 h～2 h，隨著時間延長，大部分SDF逐漸被提取出來，微波輔助酶法提取SDF得率顯著上升；在提取2 h以后，由于大部分SDF已被提取出，而且長時間的提取導(dǎo)致大量的雜質(zhì)溶出，影響微波輔助酶法提取SDF得率，因此酶解時間應(yīng)控制在2 h左右最為適宜。

2.1.2 pH、纖維素酶添加量對提取SDF得率的影響

選取不同的pH提取提取SDF，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH與SDF得率的關(guān)系Fig.3 Relation of pH and SDF extraction rate

由圖3看出，隨著pH的上升，微波輔助酶法提取SDF得率呈增長趨勢；在pH增至5以后，微波輔助酶法提取SDF得率有所下降，這可能因為隨著pH的增大，影響了纖維素酶活性，因此pH應(yīng)控制在5左右最為適宜。

選取不同纖維素酶添加量提取SDF，結(jié)果如圖4所示。

圖4 纖維素酶添加量對SDF得率的關(guān)系Fig.4 Relation of amount of cellulose enzyme and SDF extraction rate

研究表明，纖維素酶添加量在0.7%時，微波輔助酶法提取SDF得率達到39.3%，在纖維素酶添加量增至0.7%以后，微波輔助酶法提取SDF得率反而下降，這可能因為隨著纖維素酶添加量增加，不溶性膳食纖維降解為多糖和單糖，在乙醇沉淀時，不能被沉淀下來，使得SDF得率下降。因此纖維素酶添加量應(yīng)控制在0.7%左右最為適宜。

2.2 微波輔助酶法提取SDF工藝條件優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗，選取顯著因素的最優(yōu)試驗范圍，以微波輔助酶法提取SDF得率為優(yōu)化指標，對微波輔助酶法提取SDF得率工藝條件進行響應(yīng)面分析，從而優(yōu)化其最佳工藝。試驗結(jié)果、回歸方程圖及響應(yīng)面方差分析結(jié)果見表2、表3。

表2 微波輔助酶法提取SDF設(shè)計試驗及結(jié)果Table 2 Test design and results of SDF extraction by microwave assisted enzymatic

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 The variance analysis of regression equation

2.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

根據(jù)微波輔助酶法提取SDF的試驗結(jié)果，由響應(yīng)面分析法得出關(guān)于微波輔助酶法提取SDF得率的二次回歸擬合方程：

SDF得率（%）=39.27-4.01A+3.42B-1.26C-2.41D-0.95AB+3.51AC+5.18AD+1.79BC-7.63BD+2.44CD-3.54 A2-2.83B2-2.42C2-3.11D2（式中：A為微波功率；B為酶解時間；C為pH；D為纖維素酶添加量），對該方程的回歸分析和方差分析如表3所示。

對微波輔助酶法提取SDF的試驗結(jié)果進行多元回歸分析，由回歸方程各項的方差分析結(jié)果（表3）可以看出，Model的 F 值為 29 989.13，P 值為＜0.000 1，表明Model極顯著，同時A-微波功率、B-酶解時間、C-pH、D-纖維素酶添加量四個因素都是顯著因素，A-微波功率與B-酶解時間、C-pH、D-纖維素酶添加量的交互作用都顯著，B-酶解時間與C-pH、D-纖維素酶添加量的交互作用也都顯著，C-pH與D-纖維素酶添加量的交互作用也顯著。而失擬項的F值為1.51，P值為0.3251，說明了該模型與微波輔助酶法提取SDF實際情況擬合程度比較好，可以預(yù)測微波輔助酶法提取SDF最佳提取條件。根據(jù)回歸分析結(jié)果（表3），做出相應(yīng)曲面圖。

圖5、圖6、圖7和圖9的響應(yīng)面坡度較為陡峭，表明微波功率與酶解時間交互作用、微波功率與纖維素酶添加量交互作用、微波功率與pH交互作用、酶解時間與纖維素酶添加量交互作用對SDF得率影響比較大，SDF得率對其改變較為敏感，圖8和圖10的響應(yīng)面則較為平緩，說明酶解時間與pH交互作用、pH與纖維素酶添加量交互作用對SDF得率的影響一般。

用Design Expert8.05軟件對回歸模型進行分析后，得出微波輔助酶法提取SDF最佳工藝條件，即微波功率為519.28 W，酶解時間為2.48 h，pH為4.55，纖維素酶添加量為0.55%，SDF的提取理論值是39.9%。

為檢驗響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的可靠性，采用微波功率為519.28 W，酶解時間為2.48 h，pH為4.55，纖維素酶添加量為0.55%的條件對SDF進行提取，實際測得的豆SDF的提取率為39.7%，其相對誤差小于0.2%，因此該優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確可靠。

圖5 微波功率與酶解時間對SDF得率影響Fig.5 Influence of microwave power and enzymatic hydrolysis time interaction on SDF extraction rate

圖6 微波功率與pH對SDF得率影響Fig.6 Influence of microwave power and pH interaction on SDF extraction rate

圖7 微波功率與纖維素酶添加量對SDF得率影響Fig.7 Influence of microwave power and amount of cellulose enzyme interaction on SDF extraction rate

圖8 酶解時間與pH對SDF得率影響Fig.8 Influence of enzymatic hydrolysis time and pH interaction on SDF extraction rate

圖9 酶解時間與纖維素酶添加量對SDF得率影響Fig.9 Influence of enzymatic hydrolysis time and amount of cellulose enzyme interaction on SDF extraction rate

微波輔助酶法主要是通過微波爐產(chǎn)生的高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)到達豆渣細胞內(nèi)部，待豆渣細胞吸收一定的微波能后，細胞內(nèi)部的溫度逐漸上升，最終使細胞內(nèi)部的壓力超過細胞膜、細胞壁所能承受的壓力，從而使豆渣細胞脹破，產(chǎn)生微小的裂紋和孔洞，而細胞外的溶劑就能夠從這些細微的孔洞和裂紋中進入到細胞內(nèi)，溶劑可以溶解并釋放更多的胞內(nèi)SDF，同時微波產(chǎn)生的電磁場可以加速SDF分子向外擴散的速率，使SDF分子更多的溶解在溶劑中。

圖10 pH與纖維素酶添加量對SDF得率影響Fig.10 Influence of pH and amount of cellulose enzyme interaction on SDF extraction rate

3 結(jié)論

從影響SDF得率的主要因素：超聲波功率、酶解時間、pH和纖維素酶添加量入手，通過單因素實驗確定各自變量及相關(guān)水平，在此基礎(chǔ)上進行中心組合旋轉(zhuǎn)實驗設(shè)計，并采用響應(yīng)面法微波輔助酶法提取SDF的條件進行優(yōu)化：在微波功率約519.28 W，pH 4.55，加酶量0.55%，提取時間為2.48 h，得到的SDF最大提取率為39.9%，與預(yù)測值39.9%相比其相對誤差為0.2%，最優(yōu)提取工藝準確可靠。與傳統(tǒng)方法提取豆渣水溶性膳食纖維相比，SDF得率有了明顯提高，其工藝參數(shù)可供生產(chǎn)應(yīng)用參考。

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