鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定

馮永勝 衣服德 （山東省青島市畜牧獸醫(yī)研究所 266100）陳正平 （青島市嶗山區(qū)沙子口街道畜牧獸醫(yī)站）

鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定

馮永勝 衣服德 （山東省青島市畜牧獸醫(yī)研究所 266100）陳正平 （青島市嶗山區(qū)沙子口街道畜牧獸醫(yī)站）

鴨病毒性肝炎(DVH)是由鴨肝炎病毒(DHV)引起雛鴨的一種以肝臟出血性炎癥為特征的急性烈性傳染病。該病在許多國(guó)家廣泛傳播，使養(yǎng)鴨業(yè)遭受重大損失。近年來(lái)，在許多地區(qū)時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。為了有效控制該病的發(fā)生和流行，筆者從患病鴨群中分離了DHV分離株，并進(jìn)行了初步的鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 DHVI型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；9～11日齡SPF雞胚購(gòu)山東省家禽研究所；11～12日齡非免疫鴨胚購(gòu)自濰坊某孵化場(chǎng)；4日齡雛鴨購(gòu)自濰坊某種鴨場(chǎng)。

1.2 病料的采集 將DVH病鴨無(wú)菌采集肝臟。接種普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，分別在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24h。觀(guān)察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。將病料研碎，與滅菌生理鹽水按照1:5混勻，然后加入終濃度為1000U/ml的青霉素和鏈霉素，于4℃冰箱中過(guò)夜。3000r/min離心10min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒的分離與培養(yǎng) 將病料上清液經(jīng)尿囊腔接種11～12日齡非免疫鴨胚各20只(0.2ml/枚)，于37.5℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。棄去24h內(nèi)死亡的鴨胚，以后每隔12h觀(guān)察1次，收集死亡鴨胚的尿囊液，觀(guān)察鴨胚病變。按同樣的方法，將病毒連續(xù)盲傳5代。

1.4 RT-PCR檢測(cè) 參照GenBank中發(fā)表的DHV VP1基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，引物由上海捷瑞公司合成。按照TRIzol試劑(Invitrogen公司)說(shuō)明，用SDS-蛋白酶K法提取病毒RNA。反轉(zhuǎn)錄后，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取10.0μl反應(yīng)產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖中進(jìn)行電泳分析。

1.5 血清學(xué)特性觀(guān)察 取一定量的DHV分離株按1:2、1:20、1:200和1:2000倍稀釋?zhuān)尤氲润w積的I型DHV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，并加入終濃度均為100 U/ml的青霉素和鏈霉素。于37℃溫箱作用60min后，接種11～12日齡鴨胚各10枚(0.2ml/只)。另取5枚鴨胚經(jīng)尿囊腔接種0.1ml DHV病毒液作為陽(yáng)性對(duì)照，另取5枚不接種作為空白對(duì)照。相同條件下培養(yǎng)，連續(xù)觀(guān)察7d。

1.6 毒力測(cè)定 將DHV分離株進(jìn)行1:1×102、1:1×103、1:1×104、1:1×105、1:1×106稀釋?zhuān)臃N11～12日齡鴨胚各10枚(0.2ml/只)。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。接種后，棄去24h內(nèi)死亡的鴨胚，每天觀(guān)察鴨胚的死亡情況，連續(xù)觀(guān)察6d。按Reed-Muench法計(jì)算ELD50。

1.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 選擇50只4日齡雛鴨，隨機(jī)分為5組，每組10只。將病料接種雛鴨，腿部肌肉注射，0.2 ml/只。對(duì)照組雛鴨注射相同劑量的生理鹽水。觀(guān)察并記錄雛鴨的臨床表現(xiàn)和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 病料接種在11～12日齡鴨胚傳5代后，基本穩(wěn)定在48～96h胚胎死亡，死亡率可達(dá)90%以上（鴨胚傳代死亡情況見(jiàn)表1）。死亡鴨胚發(fā)育受阻，全身皮膚和皮下充血和出血，腹部和后肢嚴(yán)重水腫，肝呈黃紅色，腫大，并有針頭大小出血點(diǎn)和壞死灶。該病毒株對(duì)鴨胚ELD50按照毒力測(cè)定方法測(cè)定結(jié)果為105.33。

表1 DHV分離株各代次鴨胚不同死亡時(shí)間的死亡率

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 DVH病鴨肝臟中提取RNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增出0.5kbp大小的片段，與預(yù)期大小一致。采用RT-PCR方法檢測(cè)鴨胚尿囊液中是否有禽呼腸孤病毒、禽淋巴細(xì)胞白血病病毒等，結(jié)果均為陰性。接種雞胚比正常雞胚小，孵至21日齡后仍不能出殼而出現(xiàn)死胚。所分離的病毒不能凝集雞紅細(xì)胞，判定為DHV單一感染。

2.3 分離病毒的血清學(xué)特性 將DHV分離株與I型DHV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孵育，接種鴨胚。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株1:2稀釋液被DHV陽(yáng)性血清中和后，24～144h的鴨胚死亡率為100%，1:2000稀釋液被DHV陽(yáng)性血清中和后，24～144h的鴨胚死亡率分別為80%，這株病毒與I型DHV陽(yáng)性血清的交叉保護(hù)率為20%。

表2 I型DHV陽(yáng)性血清對(duì)DHV分離株的交叉保護(hù)率

2.4 分離株對(duì)雛鴨的致病性 將分離株按照 0.2ml/只接種雛鴨，其對(duì)雛鴨的致死率為 30%～60%。雛鴨在接種后2～3d達(dá)到死亡高峰，表現(xiàn)為突然發(fā)病、不食，死亡快，發(fā)病鴨共濟(jì)失調(diào)，全身抽搐，臨死前雛鴨橫臥，雙腿呈劃水狀，出現(xiàn)背脖后仰現(xiàn)象，死亡時(shí)角弓反張，剖檢病變主要表現(xiàn)為肝臟出血等病毒性肝炎特征性病變。

3 小結(jié)

鴨傳染性肝炎是困擾養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一，死亡率高達(dá)30%～90%。但是，近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)該病出現(xiàn)變異株或新型毒株，使病毒性肝炎連續(xù)不斷發(fā)生。這種發(fā)病規(guī)律與該研究對(duì)其病原學(xué)的研究結(jié)果一致。該分離的DHV毒株對(duì)鴨胚具有高致病性，均符合DHV的目前流行特點(diǎn)，分離株對(duì)鴨胚的致死率為30%～60%，與I型病毒性肝炎陽(yáng)性血清幾乎不能提供交叉保護(hù)。該研究從發(fā)病鴨群中分離到的分離株，明確了病原，為開(kāi)展該病的防制工作提供了科學(xué)依據(jù)。

S858.32

B

1007-1733(2014)06-0054-02

2014–03–28）