宮頸病灶HSV-2感染及其與宮頸癌的關(guān)聯(lián)性

李成德，李玲，歐麗紅，雷偉華，成卓梅，鄧超樺，李海珠，莫燕芳

(肇慶市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東肇慶 526020)

宮頸病灶HSV-2感染及其與宮頸癌的關(guān)聯(lián)性

李成德，李玲，歐麗紅，雷偉華，成卓梅，鄧超樺，李海珠，莫燕芳

(肇慶市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東肇慶 526020)

目的觀察宮頸病灶中單純皰疹病毒-2(HSV-2)感染狀況，探討宮頸HSV-2感染與宮頸癌的關(guān)聯(lián)性。方法101例宮頸病變患者中宮頸癌患者46例(癌變組)，宮頸良性疾病55例(對(duì)照組)，分別對(duì)其宮頸病灶組織和宮頸分泌物進(jìn)行HSV-2 DNA(實(shí)時(shí)熒光PCR法)和人乳頭瘤病毒(HPV)基因分型(快速導(dǎo)流雜交法)檢測(cè)。結(jié)果宮頸病灶HSV-2 DNA陽性率為10.89%；其中癌變組HSV-2的陽性率為17.39%，對(duì)照組為5.45%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。宮頸病灶HPV總陽性率為67.33%，共檢測(cè)出13種HPV亞型，以16型最多見(45.45%)；癌變組(97.83%)與對(duì)照組(41.82%)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.087，P＜0.001)。HSV-2與HPV合并陽性率為9.90%，HSV-2感染的癌變組中HPV陽性率達(dá)100%，混合感染的亞型主要為HPV16占75%。結(jié)論HSV-2多與HPV 16亞型合并感染宮頸癌患者，其在宮頸癌演變過程中的潛在影響不能忽視。

宮頸癌；單純皰疹病毒- 2；宮頸組織；人乳頭瘤病毒

宮頸癌是導(dǎo)致婦科患者死亡的主要惡性腫瘤，也是目前已明確病因的極少數(shù)惡性腫瘤之一，許多研究證實(shí)HPV感染是宮頸癌的必要因素，但在致癌過程中它并非單獨(dú)起作用，還需要一些其他因素來協(xié)同或推動(dòng)疾病進(jìn)程。單純皰疹病毒(Herpes simplex virus-2，HSV-2)曾是最早被認(rèn)為在誘發(fā)宮頸癌過程中起重要作用的一種病毒[1]，其與宮頸癌之間的關(guān)系一直存在爭(zhēng)議[2-7]。筆者分別對(duì)101例以病理學(xué)診斷為確診標(biāo)準(zhǔn)的宮頸病變患者的宮頸病灶組織和宮頸分泌物進(jìn)行HSV-2 DNA實(shí)時(shí)熒光PCR和快速導(dǎo)流雜交法人乳頭瘤病毒(HPV)基因分型檢測(cè)，探討HSV-2與HPV、HSV-2與HPV亞型及其與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)性，為宮頸癌的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源收集2011年1月至2012年12月本院婦科臨床資料比較完整的部分手術(shù)患者101例，所有患者的沙眼衣原體、梅毒螺旋體、人類免疫缺陷病毒、Epstein Barr病毒和人巨細(xì)胞病毒病源體核酸檢測(cè)均為陰性。其中癌變組宮頸癌患者46例，年齡32～65歲，平均(42.4±14.6)歲，臨床分期參照2010年國際婦女產(chǎn)科協(xié)會(huì)FIGO分期系統(tǒng)分期：0～Ⅰ期16例，Ⅱ期13例，Ⅲ期12例，Ⅳ期5例；按病理分化程度：低分化癌6例，中分化癌18例，高分化癌22例。宮頸良性疾病(子宮肌瘤5例、宮頸炎15例、CIN 1級(jí)12例，CIN 2級(jí)16例和CIN 3級(jí)7例)55例作為對(duì)照組，年齡28～61歲，平均(43.1±15.2)歲，兩組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 標(biāo)本采集采集患者宮頸病灶新鮮組織和宮頸分泌物標(biāo)本，宮頸病灶組織即由婦科醫(yī)生經(jīng)活檢或手術(shù)切除術(shù)留取子宮頸癌灶新鮮組織，用無菌剪將組織剪成薄片約0.2 cm大小3～5片，放入由凱普生物有限公司提供的有保存液的專用標(biāo)本管中；宮頸分泌物標(biāo)本取樣步驟和要求：先用棉拭子將陰道或?qū)m頸口過多的分泌物輕輕擦拭干凈，再用宮頸刷緊貼宮頸口稍用力順時(shí)針旋轉(zhuǎn)2～3圈，然后放入同樣的專用標(biāo)本管中；以上標(biāo)本均于-20℃保存，1個(gè)月內(nèi)測(cè)定。

1.3 儀器和試劑基因擴(kuò)增儀為美國MJ OPTICON-2實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀、HSV-2 DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。醫(yī)用核酸分子快速雜交儀HHM-2型及配套HPV核酸擴(kuò)增和雜交分型試劑盒均由廣東凱普生物科技有限公司提供(采用快速導(dǎo)流雜交法檢測(cè)6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和CP8304等21種HPV基因型)。蛋白酶K購自AMRESCO公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法組織標(biāo)本室溫解凍后，用500 μl消化液(50 mmol/LTris，pH 8.5，200 mg/L蛋白酶K)懸浮組織，37℃反應(yīng)過夜或45℃3 h。其余操作程序同宮頸分泌物標(biāo)本檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑說明書步驟進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸病灶新鮮組織和宮頸分泌物檢測(cè)的結(jié)果HSV-2 DNA陽性率一致，差別僅在兩種標(biāo)本檢測(cè)陽性擴(kuò)增曲線出現(xiàn)相差0.5～2個(gè)CT值；HPV分型檢測(cè)結(jié)果完全一致。

2.2 宮頸病灶HSV-2的感染狀況HSV-2 DNA陽性率為10.89%(11/101)；其中癌變組HSV-2的陽性率為17.39%(8/46)；以FIGO分期：0～Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期的陽性率分別為6.25%(1/16)、15.38%(2/13)、33.33%(4/12)和20.00%(1/5)；以病理分化程度：低分化癌、中分化癌和高分化癌陽性率分別為16.67%(1/6)、22.22%(4/18)和13.64%(3/22)；對(duì)照組陽性率為5.45%，兩組間HSV-2陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 HPV基因分型檢測(cè)結(jié)果宮頸病灶HPV分型檢測(cè)陽性率為67.33%(69/101)，共檢測(cè)出13種HPV亞型(6、11、16、18、31、39、52、53、58、59、66、68和CP8304)，以16型最多見達(dá)45.45%。癌變組中16型占47.83%(22/46)；其余亞型以52型(15.58%)、58型(12.99%)和18型(7.79%)多見。癌變組HPV分型陽性率為97.83%(45/46)，與對(duì)照組的41.82%(23/55)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.087，P＜0.001)。兩個(gè)或兩個(gè)以上型混合感染為6.93%(7/101)，見表1。

表1 HPV基因分型檢測(cè)結(jié)果及檢出型別構(gòu)成[例(%)]

2.4 宮頸病灶中HSV-2與HPV合并感染狀況宮頸病灶HSV-2與HPV合并陽性率為9.90% (10/101)，癌變組與對(duì)照組HSV-2與HPV合并陽性率分別為17.78%(8/45)和4.34%(1/23)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；HSV-2感染的癌變組中HPV陽性率為100%(8/8)；與HSV-2混合感染的亞型主要為HPV16，占75%(6/8)，對(duì)照組為0。

3 討論

HSV-2屬于皰疹病毒其中一型，原發(fā)感染常引起生殖器皰疹，HSV-2具有腫瘤DNA病毒的性能，可刺激感染的宿主細(xì)胞DNA和RNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)變而呈現(xiàn)致癌能力。HSV-2 DNA還可以整合多種正常組織的DNA，使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞[8]。研究[9]表明HPV感染并非唯一的宮頸癌致病因素。筆者對(duì)確診患者的宮頸病灶組織和宮頸分泌物HSV-2 DNA和HPV基因分型進(jìn)行了檢測(cè)，顯示HSV-2 DNA和HPV分型結(jié)果分別完全一致，提示：(1)宮頸病變患者合格的宮頸分泌物HSV-2檢測(cè)可預(yù)示其宮頸病灶組織中HPV存在狀況；(2)宮頸病灶組織中HSV-2、HPV合并存在可能非偶然，有必要引起關(guān)注。

20 世紀(jì)中期，HSV-2與宮頸癌相關(guān)的研究主要采用抗原或抗體技術(shù)進(jìn)行，HSV-2的檢出率較高。宋述梅等[8]直接用HSV-2感染移植宮頸，發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生率達(dá)12.76%，他們認(rèn)為不可忽視HSV-2在宮頸癌發(fā)生中的直接作用。還有研究認(rèn)為HSV-2作為輔因子誘導(dǎo)被HPV感染宮頸上皮細(xì)胞DNA損傷或染色體異常[10]，因此HSV-2被認(rèn)為在誘發(fā)宮頸癌過程中起重要作用。PCR技術(shù)出現(xiàn)后，相關(guān)報(bào)道顯示宮頸癌患者宮頸分泌物或組織中HSV-2 DNA檢出率高低不一[1-2，5-6，11]，因而，HSV-2在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用爭(zhēng)議頗多。本研究中，101例宮頸病灶HSV-2 DNA陽性率10.89%；其中癌變組HSV-2的陽性率為17.39%，以FIGO分期的癌變組Ⅲ期為33.33%，最多見。說明宮頸病變患者HSV-2的感染率不高，若由此把HSV-2視作宮頸癌發(fā)展的輔助因子的假設(shè)不容易讓人接受[12]。

1974年Zur Hausen提出了人乳頭狀瘤病毒與宮頸癌發(fā)病有關(guān)的假設(shè)，1995年國際癌癥研究協(xié)會(huì)(IARC)專題討論會(huì)認(rèn)為HPV感染是宮頸癌的主要病因[13]，WHO于1996年宣布HPV是引起宮頸癌變的首要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在宮頸癌中HPV檢測(cè)陽性率近100%，共檢測(cè)出13種亞型，其中以16型最多見占47.83%，驗(yàn)證了這一結(jié)論。

1982年Zur Hausen還提出HSV-2作為“啟動(dòng)子”與HPV協(xié)同致癌學(xué)說，認(rèn)為HSV-2作為“啟動(dòng)子”反覆感染正常宮頸上皮，在“促進(jìn)子”HPV的協(xié)同作用下致細(xì)胞惡變。該假設(shè)似乎可以解釋宮頸癌患者活檢組織中缺乏HSV-2 DNA，然而迄今尚未獲得足夠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究中宮頸病變標(biāo)本癌變組HSV-2的陽性率為17.39%，HSV-2與HPV合并陽性率為9.90%，提示宮頸癌患者感染HSV-2非高概率事件，宮頸細(xì)胞中HSV-2可以與HPV感染共存，且在宮頸癌組織中檢測(cè)到兩者的DNA。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒突變是在一個(gè)裂解感染周期中的早期事件，表明宮頸細(xì)胞甚至可以由被包裝有缺陷的病毒基因組發(fā)生突變[10]。因此，盡管人群中宮頸癌的發(fā)生是低概率事件，宮頸病變患者HSV-2的感染率也不高，HSV-2在宮頸癌演變過程中的潛在影響還是不能忽視。

Matovina等[14]研究表明7.4%的宮頸病變組織中存在HPV16 DNA整合現(xiàn)象，且整合現(xiàn)象只發(fā)生在重度宮頸病變組織中，認(rèn)為整合是宮頸病變進(jìn)展過程中的一個(gè)重要事件，盡管此整合僅是一個(gè)隨機(jī)事件。本組研究結(jié)果顯示HSV-2感染的癌變組中HPV陽性率為100%，混合感染的HPV亞型主要為16型占75%，提示在宮頸癌患者中，HSV-2多與HPV16型合并感染。但HSV-2在宮頸病變過程中是否起到啟動(dòng)或推動(dòng)作用，尚需更深入的研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，HSV-2出現(xiàn)在宮頸病灶中是低概率事件，不是宮頸癌致病的主要因素，但由于該病毒的致病特點(diǎn)，宮頸病灶HSV-2的持續(xù)存在極有可能在宮頸癌演變中起到重要作用，因此，臨床上不應(yīng)忽視對(duì)HSV-2感染的宮頸病變患者的診治。

[1]韓存芝,鄭曙民,荊潔線,等.宮頸癌患者病毒感染及其細(xì)胞因子水平變化的調(diào)查研究[J].腫瘤防治研究,2005,32(7):442-444.

[2]Frenkel N,Roizman B,Cassai E,et al.A DNA fragment of herpes simplex 2 and its transcription in human cervical cancer tissue[J]. Proc NatAcad Sci USA1972,69(12):3784-3789.

[3]Nahmias AJ,Shore SL,Kohl S,et al.Immunology of herpes simplex virus infection:relevance to herpes simplex virus vaccines and cervical cancer[J].Cancer Research,1976,36:836-844.

[4]Daling JR,Madeleine MM,McKnight B,et al.The relationship of human papillomavirus related cervical tumors to cigarette smoking, oral contraceptive use,and prior herpes simplex virus type 2 infection[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1996,5:541-548.

[5]Tran-Thanh D,Provencher D,Koushik A,et al.Herpes simplex virus typeⅡis not a cofactor to human papillomavirus in cancer of the uterine cervix[J].Am J Obstet Gynecol,2003,188(1):129-134.

[6]李曼紅,林瑩,莊堅(jiān).單純皰疹病毒2型感染及其C-erbB2表達(dá)與宮頸癌關(guān)系的研究[J].中國基層醫(yī)藥,2004,11(6):688-689.

[7]Smith JS,Herrero R,Bosetti C,et al.Herpes simplex virus-2 as a human papillomavirus cofactor in the etiology of invasive cervical cancer[J].J Natl Cancer Inst,2002,94(21):1604-1613.

[8]宋述梅,李久香,張明和.移植性小鼠宮頸癌和增生組織中HSV II抗原的檢測(cè)[J].腫瘤防治研究,1995,22(3):144-147.

[9]劉治坤.宮頸癌病因?qū)W新進(jìn)展[J].青島醫(yī)藥衛(wèi)生,2009,41(4): 296-298.

[10]Jones C.Cervical Cancer:Is herpes simplex virus typeⅡa cofactor?[J]Clin Microbiol Rev,1995,8(4):549-556.

[11]李玲,羅慧琴,苗晉華.人乳頭瘤病毒、沙眼衣原體和單純皰疹病毒Ⅱ型感染與宮頸疾病的相關(guān)性研究[J].國際病毒學(xué)雜志, 2012,19(6):257-260.

[12]Southern SA,Herrington CS.Molecular events in uterine cervical cancer[J].Sex Transm Inf,1998,74(2):101-109.

[13]汪世平,賈政軍,何卓,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)人乳頭狀瘤病毒的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2008,28(6): 560-564.

[14]Matovina M,Sabol I,Grubisi? G,et al.Identification of human papillomavirus type 16 integration sites in high grade precancerous cervical lesions[J].Gynecol Oncol,2009,113(1):120-127.

Herpes simplex virus-2(HSV-2)infection in cervical lesions and the relationship between cervical HSV-2 infection and cervical cancer.

LI Cheng-de,LI Ling,OU Li-hong,LEI Wei-hua,CHENG Zhuo-mei,DENG Chao-hua,LI Hai-zhu,MO Yan-fang.Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Zhaoqing, Zhaoqing 526020,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe HSV-2 infection status in cervical lesions，and explore the relationship between cervical HSV-2 infection and cervical cancer.MethodsCervical lesions and cervical secretions were collected from 101 patients with cervical lesion,HSV-2 DNA(real time PCR method)and human papilloma virus(HPV) genotype(flow-through hybridization)were detected.ResultsThe positive rate of HSV-2 DNA in cervical lesions was 10.89%,and that in cancer group and control group was 17.39%and 5.45%,respectively,with no significant difference between the two groups.The positive rate of HPV test in cervical lesions was 67.33%,and 13 subtypes of HPV were found in cervical lesions.The positive rate of the most common subtype of type 16 was 45.45%,and that in cancer group and control group was 97.83%and 41.82%,respectively,with the statistically significant difference between the two groups.(χ2=34.087,P＜0.001).The positive rate of HSV-2 merged with HPV was 9.90%.The positive rate of HPV in cancer group of HSV-2 infection was 100%.mixed infections of HPV16 subtype accounted for 75%. ConclusionHSV-2 is more common in co-infected with HPV16 subtype in patients with cervical cancer,and the potential impact of HSV-2 on cervical evolution should not be ignored.

Cervical cancer;Herpes simplex virus-2(HSV-2);Cervical tissue;Human papilloma virus(HPV)

R737.33

A

1003—6350（2014）16—2395—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0934

2014-02-22)

廣東省肇慶市科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2011E181)

李成德。E-mail：lcd11@126.com