乙型肝炎外周血T淋巴細(xì)胞上CD28分子表達(dá)與病毒載量的關(guān)系

齊青松，劉志華，徐建明，鐘培星，章小東

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬東莞厚街醫(yī)院感染科，廣東 東莞 523945)

乙型肝炎外周血T淋巴細(xì)胞上CD28分子表達(dá)與病毒載量的關(guān)系

齊青松，劉志華，徐建明，鐘培星，章小東

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬東莞厚街醫(yī)院感染科，廣東 東莞 523945)

目的 分析HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者、HBeAg陽(yáng)性乙肝病毒攜帶者外周血T淋巴細(xì)胞上CD28表達(dá)情況及其與HBV病毒載量的關(guān)系。方法采集健康人、HBeAg陽(yáng)性乙肝病毒攜帶者、HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者的外周血，抗體標(biāo)記，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)C、C、CC、CCT淋巴細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)肝功能HBV DNA。結(jié)果慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CCT細(xì)胞、CCT細(xì)胞百分率明顯低于健康對(duì)照組(P＜0.05)；HBV DNA≥107組CCT細(xì)胞百分率低于HBV DNA＜107組(P＜0.05)。結(jié)論乙型肝炎病毒感染者CT細(xì)胞上CD28的低表達(dá)與高病毒載量有關(guān)。

乙型肝炎；T淋巴細(xì)胞；CD28

乙型肝炎慢性化機(jī)制尚未完全弄清，目前已經(jīng)明確感染者的免疫反應(yīng)在疾病轉(zhuǎn)歸中起重要作用。強(qiáng)有力的免疫反應(yīng)能對(duì)病毒多種抗原產(chǎn)生特異性抗體最終清除病毒，低下的免疫反應(yīng)不僅不能控制病毒復(fù)制還可能導(dǎo)致持續(xù)感染和疾病進(jìn)展。已經(jīng)有研究表明，CT淋巴細(xì)胞在病毒清除過(guò)程中起關(guān)鍵作用[1-2]。T淋巴細(xì)胞正常行使功能需要被激活，而它的活化需要共刺激信號(hào)，CD28是T細(xì)胞上重要的共刺激分子，能與抗原遞呈細(xì)胞上B7分子結(jié)合產(chǎn)生共刺激信號(hào)，對(duì)T細(xì)胞活化起關(guān)鍵作用[3]。盡管各種治療方法的運(yùn)用包括抗病毒藥物的使用，能夠最終清除病毒的慢性乙型肝炎病例為數(shù)較少，因此我們檢測(cè)慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群并分析其CD28分子表達(dá)情況，探究其因果關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象來(lái)自2012年7月至2013年8月廣東醫(yī)學(xué)院附屬東莞市厚街醫(yī)院傳染科門(mén)診和住院患者，對(duì)照組來(lái)自本院職工。從符合抗病毒標(biāo)準(zhǔn)[4]的HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者中，知情同意后，抽取22例患者準(zhǔn)備接受抗病毒治療為A組，其中男性13例，女性9例，年齡21～45歲，平均(29.59± 7.35)歲；另抽取21例HBeAg陽(yáng)性慢性乙肝病毒攜帶者為B組，其中男性13例，女性8例，年齡20～45歲，平均(31.33±7.81)歲；本院HBsAg陰性的健康職工中抽取20例為C組，其中男性12例，女性8例，年齡21～42歲，平均(31.15±5.04)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)6個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗乙肝病毒、免疫抑制劑等藥物；(2)同時(shí)感染甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、HIV；(3)伴有其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病(惡性腫瘤、嚴(yán)重心臟病、糖尿病等)或免疫性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑儀器 Anti-Human CD3PE-Cy7、Anti-Human CD4FITC、Anti-Human CD8APC、Anti-Human CD28PE購(gòu)自美國(guó) ebioscience公司，BD-FACS CaliburⅡ流式細(xì)胞分析儀生產(chǎn)商為美國(guó)Becton，Dickinson and Company。

1.2.2 細(xì)胞染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析 EDTA抗凝管抽取靜脈血3 ml，1 500 r/min離心5 min后3 ml D-Hanks液小心稀釋沉淀，再次1 500 r/min離心20 min后小心將白膜層細(xì)胞吸出。D-Hanks液洗滌一次后，加入Anti-Human CD3PE-Cy7、Anti-Human CD4FITC、Anti-Human CD8APC、Anti-Human CD28PE抗體室溫避光染色30 min，然后2%小牛血清磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，BD-FACS CaliburⅡ流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)并分析結(jié)果。

1.2.3 其他項(xiàng)目檢測(cè) HBV-DNA定量檢測(cè)采用ABI 7000檢測(cè)儀，乙肝六項(xiàng)、甲丙丁戊肝抗體、HIV抗體檢測(cè)采用ELISA方法進(jìn)行，肝功能使用貝克曼DXC800自動(dòng)化分析儀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行，各組標(biāo)準(zhǔn)化的樣本數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較三組外周血T淋巴細(xì)胞亞群 各T細(xì)胞亞群數(shù)值以其占CT細(xì)胞百分比計(jì)算。A組(慢性乙型肝炎組)、B組(乙肝病毒攜帶組)CCT細(xì)胞、CCT細(xì)胞、CT細(xì)胞百分率低于C組(健康對(duì)照組)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，A組、B組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 按病毒載量高低分組比較兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群 高病毒載量組(HBV DNA≥107)、低病毒載量組(HBV DNA＜107)比較：高病毒載量組CT細(xì)胞、CCT細(xì)胞百分率低于低病毒載量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，高病毒載量組CCT細(xì)胞百分率低于低病毒載量組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 單個(gè)研究對(duì)象T淋巴淋巴亞群檢測(cè)結(jié)果舉例 慢性乙型肝炎患者CCT淋巴細(xì)胞占26.96%、CCT淋巴細(xì)胞占19.86%(見(jiàn)圖1)；乙肝攜帶者CCT淋巴細(xì)胞占26.65%、CCT淋巴細(xì)胞占17.84%(見(jiàn)圖2)；健康人CCT淋巴細(xì)胞占30.36%、CCT淋巴細(xì)胞占20.42%(見(jiàn)圖3)。

表1 三組T細(xì)胞亞群結(jié)果比較(%，±s)

表1 三組T細(xì)胞亞群結(jié)果比較(%，±s)

表2 不同病毒載量患者T細(xì)胞亞群結(jié)果比較(%，±s)

表2 不同病毒載量患者T細(xì)胞亞群結(jié)果比較(%，±s)

圖1 慢乙肝患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群上CD28分子表達(dá)

圖2 乙肝攜帶外周血T淋巴細(xì)胞亞群上CD28分子表達(dá)

圖3 健康人外周血T淋巴細(xì)胞亞群上CD28分子表達(dá)

3 討論

本研究采用流式細(xì)胞儀對(duì)慢性乙型肝炎、乙肝攜帶者、健康人群外周血T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)，比較CD28分子表達(dá)情況，檢測(cè)數(shù)據(jù)為各T淋巴細(xì)胞亞群占CT細(xì)胞的百分率。結(jié)果顯示：慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CCT細(xì)胞、CCT細(xì)胞百分率低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相同。雖然乙肝病毒攜帶者CCT細(xì)胞、CCT細(xì)胞百分率低于慢性乙型肝炎，但兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，究其原因，可能慢性乙型肝炎、乙肝病毒攜帶者同處免疫耐受狀態(tài)，只是免疫耐受程度稍有差異，沒(méi)有本質(zhì)上的區(qū)別。我們按照病毒載量高低分為HBV DNA≥107、HBV DNA＜107兩組，結(jié)果顯示病毒載量越高，CCT細(xì)胞百分率越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CCT細(xì)胞百分率并不受HBV病毒載量的影響，提示HBV高復(fù)制只影響CCT細(xì)胞。國(guó)外曾經(jīng)有報(bào)道稱(chēng)HIV、EBV等病毒感染也出現(xiàn)同樣表現(xiàn)[9-10]，結(jié)合目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步得出結(jié)論，乙型肝炎病毒感染者CCT細(xì)胞減少與高病毒載量有關(guān)，其原因可能是特異性CTL長(zhǎng)期暴露于大量HBV抗原刺激，導(dǎo)致CCT細(xì)胞消耗性減少。

最近有研究發(fā)現(xiàn)[11]，慢性乙型肝炎患者外周血游離CD28較健康人增多，結(jié)合慢性乙型肝炎患者CCT細(xì)胞減少這一現(xiàn)象是否暗示著：CCT細(xì)胞減少另外一個(gè)原因可能是CCT細(xì)胞上C分子與之解離導(dǎo)致？這需要進(jìn)一步論證。本研究沒(méi)有對(duì)各T細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)進(jìn)行分析，不能完全準(zhǔn)確反映其數(shù)量變化，因此存在一定的局限性，這些問(wèn)題將在下一步研究中完善。

(志謝：感謝廣東醫(yī)學(xué)院東莞松山湖校區(qū)臨床免疫學(xué)教研室陳章權(quán)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所曾今誠(chéng)兩位教授在標(biāo)本檢測(cè)技術(shù)方面的支持。)

[1]Thimme R,Wieland S,Steiger C,et al.CD8(+)T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis Bvirus infection[J].J Virol,2003,77(1):68-76.

[2]Tang TJ,Kwekkeboom J,Mancham S,et al.Intrahepatic CT-lymphocyte response is important for therapy-induced viral clearance in chronic hepatitis B infection[J].J Hepatol,2005,43(1):45-52.

[3]Acuto O,Michel F.CD28-mediated co-stimulation:a quantitative support for TCR signaling[J].Nat Rev Immunol.2003,3(12):939-951.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南[J].中國(guó)臨床醫(yī)生,2012,40(4):66-78.

[5]王沂芹,柏健鷹,傅曉嵐,等.慢性乙型肝炎患者HBV特異性CTL的CD28表達(dá)研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(4):342-344.

[6]Arasli M,Ustundag Y,DelikanlibB,et al.Peripheral blood lymphocyte dynamics and viral kinetics in patients with chronic active hepatitis B virus infection treated by tenofovir[J].Hepatogastroenterology,2012,59(115):851-857.

[7]范振平,張玲霞,楊 斌,等.乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的特點(diǎn)和意義[J].世界華人消化雜志,2005,13(2):194-197.

[8]Khanolkar A,Fuller MJ,Zajac AJ.CD4T cell-dependent CD8T cell maturation[J].J Immunol,2004,172(5):2834-2844.

[9]Paul ME,Shearer WT,Kozinetz CA,et al.Comparison of CD8(+) T-cell subsets in HIV-infected rapid progressor children versus non-rapid progressor children[J].J Allergy Clin Immunol,2001, 108(2):258-264.

[10]Catalina MD,Sullivan JL,Brody RM,et al.Phenotypic and functional heterogeneity of EBV epitope-specific CT cells[J].J Immunol, 2002,168(8):4184-4191.

[11]彭文麗,畢小云.血清可溶性共刺激因子CTLA-4和CD28在乙型肝炎患者血清中的表達(dá)及意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35 (1):82-84.

Correlation between the expression of CD28on T-lymphocyte and virus load in peripheral blood of patients with hepatitis B

QI Qing-song,LIU Zhi-hua,XU Jian-ming,ZHONG Pei-xing,ZHANG Xiao-dong
Department ofInfectious Diseases,Dongguan Houjie Hospital Affiliated to Guangdong Medical College,Dongguan 523900,Guangdong, CHINA

ObjectiveTo analyze the correlation between the expression of CD28on T-lymphocyte and virus load in peripheral blood of chronic hepatitis B patients and HBV carriers with HBeAg-positive.MethodsPeripheral blood samples were collected from healthy individuals(n=20),HBV carriers(n=21)and patients with chronic hepatitis B(n=22).After marked with the specific fluorescent antibodies,Cand Cand CCand CCT lymphocytes were detected using two or three-color flow cytometry.Meanwhile,serum ALT and hepatitis B virus(HBV) viral loads were evaluated.ResultsThe percentages of CCand CCT lymphocyte subsets were significantly higher in healthy individuals than those in chronic patients and HBV carriers(P＜0.05).The percentage of CCT lymphocyte subset was lower in the patients with high replication of HBV-DNA(more than 107copies/L)than those with low HBV replication(P＜0.05).ConclusionThe lower expression of CD28on the CT lymphocytes is related to the high HBV virus load in patients with chronic HBV infection.

Hepatitis B;T-lymphocyte;CD28

R512.6+2

A

1003—6350(2014)15—2234—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.15.0868

2014-01-07)

東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：201210515023167)

齊青松。E-mail：qqs666@163.com