軟件助力顯微鏡數(shù)字化

李升偉/編譯

軟件助力顯微鏡數(shù)字化

李升偉/編譯

機器能否判斷患者的預(yù)后？這臺顯微鏡在嘗試部分完成這項工作

● 從圖像分析軟件到安裝在手機上的無透鏡顯微鏡，計算創(chuàng)新及其新的工具正在給病理學(xué)家們提供更清晰、更富含信息的圖像。

17世紀(jì)，伽利略（Galileo）、安東尼·范·列文虎克 （Antonie van Leeuwenhoek）和羅伯特·胡克（Robert Hooke）等人，通過研磨透鏡制造出最早的顯微鏡，使人類看到了肉眼看不到的微觀生命體的奇特景致。他們第一次看到了軟木塞內(nèi)的細(xì)胞、包括血液和其他組織內(nèi)的細(xì)胞，其中，有“微生物之父”之稱的列文虎克在牙菌斑中發(fā)現(xiàn)了游動的“微動物”和觀察到精子的運動。

現(xiàn)在，物理學(xué)家和工程師們正在試圖給顯微鏡的現(xiàn)狀或發(fā)展帶來類似的改變。在大多數(shù)病理學(xué)實驗室，醫(yī)生們通常通過解讀載玻片上的組織切片來診斷疾病——例如，在難以量化的視覺信號基礎(chǔ)上對腫瘤進(jìn)行分類。然而，情況正在開始改變。正如透鏡曾經(jīng)讓人們看到了以前肉眼看不到的圖像一樣，軟件為生物學(xué)打開一扇新的窗戶。

最新的數(shù)據(jù)式工具可以使你在顯微鏡圖像內(nèi)進(jìn)行視覺搜索、自動化診斷和產(chǎn)生腫瘤基因組學(xué)表達(dá)譜的同步圖像數(shù)據(jù)。一些研究人員甚至完全扔掉了透鏡，在硬件基礎(chǔ)上制造計算顯微鏡，用于診斷或護(hù)理，尤其在缺醫(yī)少藥的貧窮地區(qū)。

從數(shù)據(jù)中挖掘

然而，病理學(xué)依然是一門頑固的模擬的和定性的科學(xué)。經(jīng)驗豐富的病理學(xué)家的主要工具是載玻片——200多年幾乎沒有改變的復(fù)式顯微鏡外加一雙眼睛。耶魯醫(yī)學(xué)院病理學(xué)家戴維·里姆（David Rimm）說：“病理學(xué)家的大多數(shù)醫(yī)療決策是根據(jù)形態(tài)學(xué)定義的。”也就是顯微鏡下細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。

當(dāng)然，方法的陳舊決不是放棄它的原因。但是，數(shù)字式病理學(xué)倡導(dǎo)者們擔(dān)憂的是（決策）不一致會帶來假陰性或誤診。比如，在鑒定罕見腫瘤時，有經(jīng)驗的病理學(xué)家往往比年輕人做得好，但是，彼此經(jīng)常出現(xiàn)判斷不一致，尤其是對同一個樣品的不同評估，這是矛盾的。

數(shù)字式病理學(xué)早期提倡者、俄亥俄州立大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)家梅廷·居爾坎 （Metin Gurcan）認(rèn)為，臨床數(shù)字化的障礙在于圖像的大小和其處理過程復(fù)雜性。首先，要將活檢組織切成多個部分并放在多個載玻片上，一個載玻片在顯微鏡下放大得到的數(shù)字式圖像大約有100億個像素，需要30千兆字節(jié)的內(nèi)存。例如，典型的前列腺穿刺活檢使用20多張載玻片，需要大約600千兆字節(jié)。

接著，便是大量的數(shù)據(jù)等待著病理學(xué)家的掃描或軟件的篩選。居爾坎說：“在這些圖像中解讀細(xì)胞數(shù)目和類型是令人難以置信的?！比欢?，一種與這種復(fù)雜性打交道的方法就是通過軟件來識別和解讀，就像人所做的那樣，而且更快速、一致。

正如人們通過學(xué)習(xí)來掌握知識那樣，軟件也可以。2011年，哈佛醫(yī)學(xué)院的病理學(xué)家安德魯·貝克（Andrew Beck）建立了一種稱為C-Path的學(xué)習(xí)軟件，結(jié)合248名患者的乳腺癌活檢圖像和生存資料，該軟件學(xué)習(xí)后可以給乳腺癌患者進(jìn)行評分和預(yù)測其存活率。

在顯微鏡下觀察活檢組織，病理學(xué)家主要憑借癌細(xì)胞三個特有的特征來甄別腫瘤的攻擊性：細(xì)胞核形狀是否異常？細(xì)胞是否正在分裂？細(xì)胞彼此是否正常連接或分離？病理學(xué)家們將這些特征逐項量化后以此確定腫瘤級別及描述其攻擊性如何。

而C-Path系統(tǒng)的工作原理是，將圖像分割成“超像素”小區(qū)域，在每個超像素內(nèi)鑒別細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，并與鄰近的超像素比對——顏色、紋理、大小和外形。對于乳腺癌，這種比對分析產(chǎn)生的特征與兩種事物相關(guān)：樣品的全結(jié)構(gòu)和其精細(xì)比例細(xì)節(jié)，例如，癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞核之間的平均距離。

最后，C-Path得到的6 642個特征結(jié)構(gòu)，在描述癌細(xì)胞自身的同時，還包括周圍基質(zhì)的連接組織。事實上，基質(zhì)形態(tài)學(xué)比單獨的癌癥形態(tài)學(xué)具有更好的存活預(yù)測因子：基質(zhì)區(qū)域形態(tài)一致與良好的預(yù)后有聯(lián)系，而被上皮細(xì)胞浸潤的基質(zhì)，則指示程度較高的進(jìn)展性癌癥。基于對數(shù)千個特征結(jié)構(gòu)的分析，C-Path做出了比標(biāo)準(zhǔn)的病理學(xué)分析更準(zhǔn)確的患者存活率分析。貝克現(xiàn)在在更廣范圍樣品中訓(xùn)練他的軟件，包括全玻片圖像和正常乳腺組織樣品。

視覺學(xué)習(xí)軟件

有可能的是，病理學(xué)家也會尋找到由C-Path計算出的數(shù)千特征結(jié)構(gòu)中的一些特征，但卻難以用詞語來表述它們。比如，將一例確診的腫瘤和在一幅照片中識別出你叔叔的經(jīng)歷進(jìn)行比對。你不能確切地說清楚他是你叔叔——是他的鼻子、眼睛還是衣服？只知道這就是他。但是，計算機卻可以量化分析一幅圖像的特征，并且可以重復(fù)。

也有人認(rèn)為，作為第二雙犀利的眼睛，軟件的正確用途應(yīng)該是幫助醫(yī)生從海量數(shù)據(jù)中尋找或?qū)δ繕?biāo)物進(jìn)行分類，以此減輕他們的工作量。安阿伯市密歇根大學(xué)的病理信息學(xué)專家尤里西斯·巴利斯（Ulysses Balis）正在開發(fā)一種稱為SVIQ的通用視覺搜索程序。

為了對SVIQ進(jìn)行實證，巴利斯通過不同角度對大腸腺癌切片的數(shù)字式圖像進(jìn)行放大和縮小，如果他發(fā)現(xiàn)有趣的東西——比如一個看似正在分裂的細(xì)胞——并想在圖像中搜索其他有相似特征的結(jié)構(gòu)，就點擊“掃描”按鈕，軟件隨即將圖像中相似的部分亮化，前后花費大約10秒時間。他說：“這可能是最簡單的二維圖像搜索結(jié)構(gòu)，是一個良好的應(yīng)急工具。 ”

與C-Path主要做診斷決策不同，SVIQ軟件可以幫助病理學(xué)家在數(shù)字式病理學(xué)圖像中發(fā)現(xiàn)興趣位點。美國國立癌癥研究所（NCI）從事病理信息學(xué)研究的賈森·希普（Jason Hipp）認(rèn)為，病理學(xué)家們所能做的是逐個對視野中一些正在分裂的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，不同的是，SVIQ可以對整個組織切片內(nèi)每個分裂細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。因此，SVIQ在提高病理學(xué)家工作效率的同時，并提供更多的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。

希普的目標(biāo)之一是將SVIQ整合進(jìn)癌癥患者的篩選過程中。通常這要從發(fā)現(xiàn)癌癥患者的遺傳學(xué)試驗開始，對于那些分散在人體內(nèi)的腫瘤，包括活檢組織在內(nèi)，一時很難發(fā)現(xiàn)足夠的癌組織進(jìn)行遺傳學(xué)篩選。一般情況下，從取出活檢組織到對其癌樣部分鑒定和染色，過程大約為 25分鐘時間。通過SVIQ軟件，病理學(xué)家從發(fā)現(xiàn)圖像中某個區(qū)域的癌細(xì)胞，到亮化與其特征相似的其他結(jié)構(gòu)部分，過程大約為5分鐘。

在倫敦癌癥研究所，生物信息學(xué)研究人員袁茵茵（Yinyin Yuan，音譯）正在將腫瘤中所有細(xì)胞類型進(jìn)行作圖，旨在獲得它們的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。她說：“腫瘤內(nèi)不同細(xì)胞群體產(chǎn)生的復(fù)雜景觀，成為了精確診斷的障礙。”由于對腫瘤部分取樣進(jìn)行的測序不能捕獲其全部圖像，進(jìn)而丟失了癌癥－細(xì)胞群體的異質(zhì)性，進(jìn)一步影響到患者的預(yù)后和他們對不同治療方案的應(yīng)答。

2012年袁開發(fā)了一款軟件，對取自300個乳腺癌組織活檢全腫瘤載玻片的大約100萬個細(xì)胞逐一進(jìn)行分類，然后與其他“組學(xué)”數(shù)據(jù)進(jìn)行集成（由100個計算芯片組成的計算機簇完成這項工作）。通過與其他腫瘤數(shù)據(jù)比對 （該軟件輸出的是數(shù)據(jù)，不是圖像），袁發(fā)現(xiàn)，那些免疫細(xì)胞滲入腫瘤的患者有更好的預(yù)后。當(dāng)圖像數(shù)據(jù)與基因表達(dá)數(shù)據(jù)連接時，這種預(yù)測得到了增強。當(dāng)病理學(xué)家凝視基因表達(dá)數(shù)據(jù)清單時，這種結(jié)果并不明顯，但當(dāng)該軟件分析圖像時，就變得清晰了。目前，袁計劃著將她的這項研究擴展到卵巢癌和肺癌中。

“醫(yī)學(xué)影像學(xué)的這些進(jìn)展類似于天體物理學(xué)領(lǐng)域發(fā)生過的故事?！痹f。當(dāng)天體物理學(xué)家擁有強大的望遠(yuǎn)鏡和數(shù)字式圖像后，他們便讓計算每個星體的這項沉悶工作交由了計算機去完成。她認(rèn)為，有了數(shù)字式顯微鏡和細(xì)胞圖像，同樣的事情也會發(fā)生在醫(yī)學(xué)影像學(xué)領(lǐng)域。

左圖是放大倍數(shù)為200的乳腺癌圖像，在預(yù)測患者預(yù)后之前，使用算法可以將其分解為超像素

數(shù)學(xué)透鏡助力

數(shù)字式圖像分析使病理學(xué)家工作變得輕松的同時，也催生新的硬件類型的產(chǎn)生，而制作數(shù)字式顯微鏡圖像，則意味著需要較為昂貴的掃描顯微鏡鏡片。目前，研究人員正在開發(fā)既掃描迅速又相對便宜的顯微鏡，旨在更多地提升軟件功能、較少依靠透鏡或其他硬件。

在傳統(tǒng)顯微鏡中，低倍透鏡是犧牲分辨率得到寬視野，而高分辨率則只能看到小的視野。在帕薩迪納加州理工學(xué)院從事顯微鏡技術(shù)研發(fā)的楊長輝（Changhuei Yang，音譯）說：“機械掃描相對緩慢。”他的解決方案是增加傳統(tǒng)顯微鏡的視野和分辨率。2013年7月，楊長輝將一架低分辨率光學(xué)顯微鏡改裝成一架高分辨率顯微鏡，進(jìn)而可以用便宜的硬件制作全玻片圖像——在0.8毫米的分辨率下觀察到120平方毫米的面積。而標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡在這個分辨率下只能提供1.1平方毫米的視野。

更進(jìn)一步的是，加州大學(xué)洛杉磯分校的電子工程師埃道甘·奧茲坎（Aydogan Ozcan）正在研發(fā)一款無透鏡的顯微鏡，擅長處理生物學(xué)“濕件”樣品，能夠完成物理透鏡所做的同樣事情：將模糊的干涉模式轉(zhuǎn)換成細(xì)胞的聚焦圖像。在細(xì)節(jié)上，其致密顯微鏡與透鏡顯微鏡完全一樣，擁有數(shù)百納米分辨率，可以清晰地顯示細(xì)胞核。

與此同時，奧茲坎還在嘗試眾包他的診斷學(xué)儀器——將顯微鏡制作的血液細(xì)胞圖像上傳到一個連線游戲上（一個非專業(yè)人士認(rèn)識感染瘧疾的細(xì)胞的教學(xué)游戲），供眾多游戲迷游戲，然后對答案做統(tǒng)計學(xué)綜合。結(jié)果，這款游戲產(chǎn)生與病理學(xué)家相同診斷的次數(shù)比例達(dá)99%。奧茲坎認(rèn)為，這款智能軟件最終能從病理學(xué)家那里接管部分事務(wù)。

亞里桑那州鳳凰城視覺門公司首席執(zhí)行官艾倫·納爾遜（Alan Nelson）認(rèn)為，計算創(chuàng)新將會給病理學(xué)領(lǐng)域帶來改變。目前，他正在研發(fā)針對血液中癌細(xì)胞三維成像的自動化檢測系統(tǒng)。他說：“機器不會給出意見，它能產(chǎn)生的是數(shù)據(jù)和基于統(tǒng)計學(xué)的診斷?！痹撓到y(tǒng)有望增加篩查速率，幫助病人更快地得到治療。

納爾遜曾是目前市場上唯一的自動化癌癥篩查儀的首席發(fā)明人，其NeoPath公司研發(fā)的宮頸癌檢測儀，在1996年獲得美國食品和藥品管理局（FDA）的批準(zhǔn)——這款檢測儀是專門為測定宮頸帕氏涂片內(nèi)癌細(xì)胞而定制，載有數(shù)百片載玻片，可以終日進(jìn)行自動化掃描。

當(dāng)今的計算機已今非昔比。納爾遜稱，在軟件的輔助下，顯微鏡可以向生物學(xué)家和醫(yī)生展示以前他們從沒看到的事物：奧茲坎的無透鏡顯微鏡已經(jīng)向人們展示了精子螺旋運動的新模式，視覺門公司的三維圖像可以向病理學(xué)家展示數(shù)百種以前無法看到的特征結(jié)構(gòu)?！拔覀兛梢郧逦乜吹椒伟┘?xì)胞核內(nèi)的表面紋理，或測量出六號染色體短臂的長度，我的上帝呀，真是太美了！”

[資料來源：Nature][責(zé)任編輯：則 鳴]