軟骨凝集蛋白與C-myc在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其意義

文 浩，劉明建，曾湘寧

（鎮(zhèn)安縣人民醫(yī)院胸外科1、病理科2，陜西 鎮(zhèn)安 711500）

軟骨凝集蛋白與C-myc在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其意義

文 浩1，劉明建2，曾湘寧1

（鎮(zhèn)安縣人民醫(yī)院胸外科1、病理科2，陜西 鎮(zhèn)安 711500）

目的探討軟骨凝集蛋白（Chondrolectin,CHODL）與C-myc在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測53例非小細(xì)胞肺癌石蠟標(biāo)本以及43例癌旁對(duì)照組織標(biāo)本，并進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果CHODL主要分布在胞質(zhì)與胞膜中，其在癌組織中的陽性表達(dá)率為79.25%，明顯高于在癌旁組織中的表達(dá)（18.60%），C-myc在癌組織中的表達(dá)率為60.37%，明顯高于其在癌旁組織中過度表達(dá)（30.23%），且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CHODL在癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與年齡、性別、組織分化、TNM分期、腫塊大小均無關(guān)；C-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、腫塊大小無關(guān)（P＞0.05），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CHODL與C-myc在肺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論CHODL在肺癌組織中的作用可能與C-myc呈某種程度的相關(guān)性，并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，為CHODL在腫瘤轉(zhuǎn)移方面打下基礎(chǔ)。

肺癌；軟骨凝集蛋白；C-myc；腫瘤標(biāo)志物

肺癌為目前全世界最常見的惡性腫瘤之一，隨著環(huán)境污染的加重，其發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢發(fā)展[1]。肺癌的發(fā)展為多因素、多階段、多基因變異的結(jié)果，發(fā)病較為隱匿，早期發(fā)現(xiàn)就診的患者極少，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)都已經(jīng)進(jìn)展為晚期階段，預(yù)后較差。因而尋找一種特異性的分子靶點(diǎn)，進(jìn)行針對(duì)性的早期診斷與靶向治療為近年來研究熱點(diǎn)。軟骨凝集蛋白(Chondrolectin，CHODL)為新發(fā)現(xiàn)的蛋白，之前研究主要集中在其在人體正常組織中表達(dá)情況，如睪丸血管平滑肌、前列腺平滑肌等[2]，然而新近研究發(fā)現(xiàn)CHODL在人肺癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲相關(guān)[3]。C-myc為一種原癌基因，其在核內(nèi)表達(dá)一種特異性DNA結(jié)合蛋白[4]，研究發(fā)現(xiàn)C-myc在人類乳腺癌[5]、胃癌[6]、腎癌[7]、結(jié)腸癌[8]、彌漫性大B細(xì)胞瘤[9]等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，參與到細(xì)胞分化、凋亡、周期與增值等過程。本研究首次探討CHODL在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況，并且進(jìn)一步研究其與C-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究所用標(biāo)本均來自我院2007年12月至2012年12月期間手術(shù)切除，并經(jīng)病理學(xué)確診為非小細(xì)胞肺癌石蠟標(biāo)本，共計(jì)53例。其中男性35例，女性18例；年齡39～74歲，中位年齡58歲；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例；高分化18例，中分化22例，低分化13例。TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：局限于黏膜或黏膜下層的早期胃癌定為T1；侵及胃壁肌層，但大小不超過一個(gè)分區(qū)的1/2者為T2；腫瘤侵及胃壁漿膜層，或雖未侵及漿膜層，但病變已大于一個(gè)分區(qū)的1/2，但未超出一個(gè)分區(qū)定位者為T3；腫瘤占一個(gè)分區(qū)以上或已累及周圍臟器定位者為T4。TNM分期T1期和T2期共34例，T3期與T4期共19例；其中T1+T2組28例，T3+T4組39例。腫瘤≥3 cm者31例，＜3 cm者22例。另取自距癌組織邊緣5 cm以上的組織，均經(jīng)HE染色證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤，無明顯細(xì)胞增生等病變的癌旁組織43例。所有的病例術(shù)前均無化療、放療及免疫治療史。

1.2 方法 所有切片均使用4%的多聚甲醛固定，然后進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)制備4 μm厚度連續(xù)切片，使用免疫組化SP法進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按照說明書依次進(jìn)行二甲苯脫蠟，檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，10%正常羊血清室溫孵育，一抗-4度過夜(CHODL抗體購自Santa Cruz公司，貨號(hào)：sc-54867，稀釋為1:200；C-myc抗體購自Santa Cruz公司，貨號(hào)：sc-40，稀釋為1:300)，進(jìn)而常溫二抗孵育、DAB顯色等步驟。使用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。SP試劑盒與DAB顯色劑均購自中山金橋生物有限公司。

1.3 結(jié)果判定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]，采用半定量積分方法，每張切片選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)不少于1 000個(gè)細(xì)胞，依據(jù)視野下陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)分：陽性細(xì)胞數(shù)為0～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，＞75%為4分。依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：細(xì)胞未著色或呈淡黃色為0分，棕黃色為1分，棕褐色為2分。采用將顯色深淺與顯色范圍評(píng)分相乘的方法進(jìn)行綜合評(píng)分，而為便于統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)一將0～3分為陰性，4～8分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，配對(duì)資料采用Spearman秩相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CHODL與C-myc在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況 結(jié)果顯示，CHODL主要分布在胞質(zhì)與胞膜中，53例癌組織中有42例高表達(dá)CHODL，其高表達(dá)率為79.25%，明顯高于CHODL在癌旁組織中的表達(dá)率(8/43，18.60%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.980，P＜0.05)；而C-myc在癌組織中的表達(dá)率為60.37%(32/53)，明顯高于其在癌旁組織中過度表達(dá)(13/43，30.23%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.663，P＜0.05)，見圖1～圖4。

圖1 CHODL在非小細(xì)胞肺癌組織中的強(qiáng)陽性表達(dá)（×400）；圖2 C-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)（×400）；圖3 陰性對(duì)照（×200）；圖4 癌旁組織（×200）。

2.2 CHODL與C-myc的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 CHODL在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.221，P=0.040)，而與年齡、性別、組織分化、TNM分期、腫塊大小均無關(guān)(P＞0.05)；C-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=6.448，P=0.011)、組織學(xué)分化(χ2=8.286，P=0.016)、TNM分期(χ2=19.145， P=0.000)有關(guān)，而與年齡、性別、腫塊大小無關(guān)(P＞0.05)，見表1。

2.3 CHODL與C-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的關(guān)系 結(jié)果顯示，53例癌組織中CHODL與C-myc同時(shí)高表達(dá)者29例，同時(shí)低表達(dá)者8例，兩者表達(dá)呈正相關(guān)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.346，P=0.012)，見表2。

表1 CHODL與C-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系(例)

表2 CHODL與C-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性(例)

3 討 論

靶向治療由于其針對(duì)性強(qiáng)，腫瘤殺傷作用明顯，副作用低，一直為近年來腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。CHODL位于21號(hào)染色體長臂，為C型凝集素家族中的一員，可以編碼一條具有碳水化合物識(shí)別區(qū)域的跨膜溶解蛋白，參與到糖蛋白的內(nèi)吞作用，由于主要定位在細(xì)胞核周圍的區(qū)域，因而轉(zhuǎn)錄過程的變異可導(dǎo)致其出現(xiàn)一些變異蛋白。C型凝集素家族是一組動(dòng)物蛋白質(zhì)，其發(fā)揮作用的鈣離子依賴性的碳水化合物結(jié)合區(qū)并不是必須的，從而區(qū)別于其他凝集素。之前的研究發(fā)現(xiàn)CHODL的生理作用主要包括細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞之間的通信、細(xì)胞與細(xì)胞之間粘附、細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞之間的粘附等[11]，如一些依賴于蛋白凝集素家族的蛋白聚糖，在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性維持上，以及ECM與外界細(xì)胞交互作用之間具有重要的作用[12]。

研究發(fā)現(xiàn)CHODL的結(jié)合體在T淋巴細(xì)胞中具有不同程度的表達(dá)，白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用部分依賴于C型凝集素跨膜結(jié)合域的體現(xiàn)的選擇作用[13]。凝集素與胚胎的發(fā)育和免疫反應(yīng)密切相關(guān)，主要通過與分子之間的識(shí)別而發(fā)揮作用。一些鈣連接蛋白，如鈣網(wǎng)蛋白，這些蛋白結(jié)合到錯(cuò)誤折疊蛋白上后可以阻止錯(cuò)誤蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的輸送，因而如果發(fā)生在腫瘤細(xì)胞中可能會(huì)有相似的作用，從而阻止致瘤蛋白的產(chǎn)生。Masuda等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，CHODL在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，并參與到腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)CHODL在非小細(xì)胞肺癌中明顯高于其在癌旁組織中的表達(dá)。

C-myc為一種原核基因，人C-myc基因定位于第8條染色體上，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，其表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核，為細(xì)胞傳導(dǎo)的下游基因，作為反式作用因子，可以直接激活轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子樣作用，決定細(xì)胞從G0/G1向S期轉(zhuǎn)變[15]。C-myc對(duì)細(xì)胞具有雙重作用，既可以刺激細(xì)胞凋亡，也可促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)C-myc蛋白的羧基端含核酸靶序列，氨基酸富含谷氨酰氨和脯氨酸，而這些都為腫瘤轉(zhuǎn)化所必需的氨基酸[16]。研究表明C-myc在人類多種惡性腫瘤中都有表達(dá)[17]。本研究亦發(fā)現(xiàn)C-myc在人非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，與之前的研究結(jié)果類似。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)CHODL在人非小細(xì)胞肺癌組織中明顯高表達(dá)，且其表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否密切相關(guān)，而C-myc同樣在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)亦明顯高于其癌旁組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤分化程度，TNM分期密切相關(guān)。兩者的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CHODL與C-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，但兩者具體機(jī)制還有待我們進(jìn)一步的探討，以期CHODL能夠成為非小細(xì)胞肺癌診斷與治療的新靶點(diǎn)。

[1]Jemal A.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1): 11-30.

[2]Weng L,Smits P,Wauters J,et al.Molecular cloning and characterization of human chondrolectin,a novel type I transmembrane protein homologous to C-type lectins[J].Genomics,2002,80(1): 62-70.

[3]Masuda K,Takano A,Oshita H,et al.Chondrolectin is a novel diagnostic biomarker and a therapeutic target for lung cancer[J].Clin Cancer Res,2011,17(24):7712-7722.

[4]Boxer LM,Dang CV.Translocations involving c-myc and c-myc function[J].Oncogene,2001,20(40):5595-5610.

[5]Todorovi?-Rakovi? N,Ne?kovi?-Konstantinovi? Z,Nikoli?-Vukosavljevi? D.C-myc as a predictive marker for chemotherapy in metastatic breast cancer[J].Clin Exp Med,2012,12(4):217-223.

[6]Sun T,Wang C,Xing J,et al.miR-429 modulates the expression of c-myc in human gastric carcinoma cells[J].Eur J Cancer,2011,47 (17):2552-2559.

[7]Gordan JD,Lal P,Dondeti VR,et al.HIF-alpha effects on c-Myc distinguish two subtypes of sporadic VHL-deficient clear cell renal carcinoma[J].Cancer Cell,2008,14(6):435-446.

[8]Chen C,Cai S,Wang G,et al.c-Myc enhances colon cancer cell-mediated angiogenesis through the regulation of HIF-1α[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,430(2):505-511.

[9]黃文亭,呂 寧,郭 蕾.c-myc基因在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的意義及其應(yīng)用[J].中華病理學(xué)雜志,2013,42(9):638-640.

[10]冼麗英,尹有群,趙東暉,等.卵巢上皮性腫瘤中Ezrin、E-cadherin及EGFR的表達(dá)及臨床意義[J].海南醫(yī)學(xué),2013,24(18):2653-2657.

[11]Zelensky AN,Gready JE.The C-type lectin-like domain superfamily[J].FEBS Lett,2005,272:6179-6217.

[12]Drickamer K,Taylor ME.Biology of animal lectins[J].Annu Rev Cell Biol,1993,9:237-264.

[13]Ellgaard L,Helenius A.Quality control in the endoplasmic reticulum[J].Nat Rev,2003,4:181-191.

[14]Masuda K,Takano A,Oshita H,et al.Chondrolectin is a novel diagnostic biomarker and a therapeutic target for lung cancer[J].Clin Cancer Res,2011,17:7712-7722.

[15]Hoffman B,Liebermann DA.Apoptotic signaling by c-MYC[J]. Oncogene,2008,27(50):6462-6472.

[16]Wang J,Zou S.The bel-2 m-RNA expression in GCDC-induced obstructive jaundice in rats and its implication in hepato-cellular apoptosis[J].J Hua zhong Univ Sci Technology Med Sci,2002,22(1): 34-36.

[17]Duan SG,Cheng L,Li DJ,et al.The role of MAPK-ERK pathway in 67-k Da laminin receptor-induced Fas L expression in human cholangio carcinoma cells[J].Dig DisSci,2010,55(10): 2844-2852.

Expression and clinical significance of chondrolectin and C-myc in human non-small cell lung cancer.WEN

Hao1,LIU Ming-jian2,ZENG Xiang-ning1.
Department of Thoracic Surgery1,Department of Pathology2,County People's Hospital of Zhenan,Zhenan 711500,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of chondrolectin and C-myc in human non-small cell lung cancer and their clinical implication.MethodsImmunohistochemical study was carried out to examine the expression of chondrolectin and C-myc and its association with clinicopathologic features in human non-small cell lung cancer.ResultsThe positive rate for chondrolectin and C-myc expression in squamous tissues (79.25%and 60.73%)was significantly higher than those in non-tumor tissues(18.60%and 30.23%);the positive expression of chondrolectin was not correlated with the patient's gender,age and histologic differentiation except that lymph node metastasis,the positive expression of C-myc was correlated with the patient's lymph node metastasis,histologic differentiation and TNM stage,but without gender,age and size.In non-small cell lung cancer chondrolectin was positively correlated with C-myc.Conclusion Chondrolectin may be an important molecular marker in human non-small cell lung cancer.

Lung cancer;Chondrolectin;C-myc;Cancer marker

R734.2

A

1003—6350（2014）09—1262—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.09.0490

2013-10-21)

文 浩。E-mail：wenhaohhh@163.com