去鐵胺對(duì)促進(jìn)擴(kuò)張后皮瓣微循環(huán)重建的實(shí)驗(yàn)研究

徐 偉，王春梅，楊思奮，代大毛

（東莞市康華醫(yī)院整形美容中心，廣東 東莞 523000）

去鐵胺對(duì)促進(jìn)擴(kuò)張后皮瓣微循環(huán)重建的實(shí)驗(yàn)研究

徐 偉，王春梅，楊思奮，代大毛

（東莞市康華醫(yī)院整形美容中心，廣東 東莞 523000）

目的探討去鐵胺(Defemxamine，DFX)對(duì)擴(kuò)張后皮瓣微循環(huán)重建的影響。方法將新西蘭大耳白兔24只分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，兔額部皮下植入圓柱形擴(kuò)張器，制備蒂部位于耳根的矩形皮瓣，實(shí)驗(yàn)組分別于模型制備后即刻、第3天、第5天將DFX注射于皮瓣末端，對(duì)照組皮下注射等量的生理鹽水，第7天分別進(jìn)行皮瓣平均微血管數(shù)目及內(nèi)徑、皮瓣組織中超氧化物歧化酶(MDA)、丙二醛(SOD)含量及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA檢測(cè)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組皮瓣SOD含量、VEGF mRNA表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.05)，平均微血管數(shù)目多于對(duì)照組(P＜0.05)，平均微血管內(nèi)徑及MDA含量小于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論在擴(kuò)張皮瓣的局部注射DFX，可以降低自由基水平，加快新生血管形成并促進(jìn)皮瓣微循環(huán)重建。

去鐵胺；擴(kuò)張皮瓣；丙二醛；超氧化物歧化酶；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

皮瓣移植在組織缺損修復(fù)和功能重建上發(fā)揮著不可替代的作用，適度的擴(kuò)張后可以增強(qiáng)皮瓣的活力，但臨床上也常發(fā)生擴(kuò)張術(shù)后Ⅱ期手術(shù)形成皮瓣(簡(jiǎn)稱擴(kuò)張皮瓣)時(shí)出現(xiàn)微循環(huán)重建障礙甚至壞死，影響治療效果，供血不足和缺血再灌流損是其中的兩個(gè)重要原因。去鐵胺(DFX)是一種鐵螫合劑，近年被發(fā)現(xiàn)具有清除氧自由基和激活缺氧反應(yīng)基因等作用[1-2]，我們實(shí)驗(yàn)通過(guò)將DFX皮瓣局部注射，觀察其對(duì)于擴(kuò)張皮瓣微循環(huán)重建的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備及分組 新西蘭大白兔24只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，氯胺酮(0.6 ml/kg體重)麻醉后取俯臥位，額部皮下潛行分離一腔，置入30 ml圓柱形皮膚軟組織擴(kuò)張器，壺閥置于雙耳根間的皮下。術(shù)后第2天起，隔日向擴(kuò)張器內(nèi)注入生理鹽水5 ml，第14天取出擴(kuò)張器，制備蒂部位于耳根，大小約為3 cm×5 cm的矩形皮瓣后原位縫回。模型制備后，將大白兔隨機(jī)分為兩組，每組12只，實(shí)驗(yàn)組：分別于模型制備后即刻、第3天、第5天將DFX 100 mg/kg(根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)確定為有效劑量)注射于距皮瓣末端1 cm和3 cm處達(dá)皮下層，對(duì)照組皮下注射等量的生理鹽水。

1.2 皮瓣相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

1.2.1 平均微血管數(shù)目及內(nèi)徑 矩形皮瓣形成后第7天于皮瓣遠(yuǎn)端組織2.0 cm處取約0.5 cm×1.0 cm大小的全層組織，對(duì)半均分，一半用于測(cè)定MDA、SOD。將組織10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，在10×40高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，通過(guò)醫(yī)學(xué)圖文數(shù)字系統(tǒng)軟件計(jì)數(shù)微血管數(shù)目，所計(jì)數(shù)血管中必須有紅細(xì)胞，并同時(shí)測(cè)量管徑大小，各組計(jì)算平均數(shù)。

1.2.2 測(cè)定皮瓣組織中MDA、SOD的含量 將取出的另一半皮瓣組織稱重，加9倍重的冰生理鹽水，用超聲勻漿機(jī)制成10%勻漿液。各取勻漿液0.1 ml， SOD活性(黃嘌呤氧化酶法)及丙二醛含量(硫代巴比妥酸比色法)測(cè)定均按試劑盒方法測(cè)定。MDA單位以nmol/10 mg濕重表示，SOD活性換算成nmol/mg濕重表示。

1.2.3 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA檢測(cè) 各取10%組織勻漿液0.1 ml，Trizol提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于PCR擴(kuò)增。VEGF引物序列：上游引物：5'-CAC TGG ACC CTG GCT TTA CT-3'，下游5'-TGC TGG CTT TGG TGA GGT T-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物320 bp；內(nèi)參GAPDH引物：上游：5'-TTA CTT GGA GGC CAT GTG GGC C-3'，下游：5'-ACT GCC ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物463 bp，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，以凝膠成像分析儀分析各條帶灰度值。各個(gè)反應(yīng)體系以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算灰度比值作為VEGF mRNA的表達(dá)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組平均皮瓣成活率、微血管數(shù)目、微血管內(nèi)徑比較 實(shí)驗(yàn)組皮瓣平均成活率顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，平均微血管數(shù)目多于對(duì)照組(P＜0.05)，平均微血管內(nèi)徑小于對(duì)照組(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組微血管豐富，多為管徑較小新生血管；對(duì)照組微血管較少，多為管徑較大固有血管。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 術(shù)后7 d皮瓣組織學(xué)觀察（×400倍）

表1 兩組微血管數(shù)目、微血管內(nèi)徑、MDA和SOD含量VEGF-mRNA表達(dá)的比較(n=12，)

表1 兩組微血管數(shù)目、微血管內(nèi)徑、MDA和SOD含量VEGF-mRNA表達(dá)的比較(n=12，)

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組t值P值平均微血管數(shù)目(個(gè)) 30.81±2.53 10.40±1.72 4.270 0.005平均微血管內(nèi)徑(mm) 22.58±4.36 113.20±19.87 1.084 0.000 MDA含量(nmol/10 mg) 3.83±0.47 6.13±0.83 0.393 0.001 SOD含量(nmol/mg) 311±65.87 224±27.12 1.097 0.003 VEGF-mRNA表達(dá)1.15±0.16 0.51±0.12 0.425 0.000

2.2 各組皮瓣組織中MDA、SOD的含量 術(shù)后7 d，實(shí)驗(yàn)組MDA含量低于對(duì)照組(P＜0.05)，SOD含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 各組皮瓣組織中VEGF mRNA的表達(dá) 電泳后各泳道均可見(jiàn)特異性條帶，與DNA標(biāo)記進(jìn)行比較，產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，實(shí)驗(yàn)組VEGF mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 術(shù)后7 d皮瓣VEGF mRNA表達(dá)

3 討 論

近年來(lái)的研究證實(shí)，氧自由基是皮瓣缺血/再灌損傷中的主要介質(zhì)[3]。在缺血缺氧的過(guò)程中，首先產(chǎn)生的氧自由基為過(guò)氧化氫和超氧陰離子，這些氧自由基在水溶液中的毒性不太大，對(duì)組織損傷輕。然而，在有鐵離子存在時(shí)，上述氧自由基可轉(zhuǎn)化成為羥自由基和其他反應(yīng)性鐵一氧復(fù)合物等毒性較大的氧自由基，容易導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物，如丙二醛(MDA)、酮基、氫過(guò)氧基以及新的氧自由基等，且損傷程度與局部鐵離子濃度成正比。氧自由基不但通過(guò)對(duì)生物膜中多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化作用引起細(xì)胞損傷，而且還能通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化分解代謝產(chǎn)物MDA，促使蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合反應(yīng)引起細(xì)胞代謝和功能障礙，甚至細(xì)胞死亡[4]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)測(cè)定MDA含量來(lái)反映過(guò)氧化脂質(zhì)，間接地反映氧自由基的產(chǎn)生情況。SOD是存在于體內(nèi)的一種重要的氧自由基清除劑，SOD活性可反映機(jī)體清除氧自由基的能力。我們觀察到，應(yīng)用DFX后，皮瓣組織MDA含量明顯降低，SOD升高，說(shuō)明DFX能降低組織中自由基水平，增強(qiáng)抗氧化能力，從而有利于皮瓣遠(yuǎn)端缺血細(xì)胞，特別是存活與壞死交界區(qū)域的“臨界”向存活的方向轉(zhuǎn)化。這可能是因?yàn)镈FX對(duì)游離鐵離子的螯合作用有利于減少由鐵離子參與的自由基產(chǎn)生，減輕了自由基對(duì)缺氧細(xì)胞的進(jìn)一步損害[1]。

擴(kuò)張皮瓣微循環(huán)重建與新生血管形成有關(guān)，而新生血管形成與VEGF有密切聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)證明，內(nèi)源性VEGF對(duì)皮瓣的成活起重要作用[5]。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的血管生長(zhǎng)因子之一，是內(nèi)皮細(xì)胞特異的強(qiáng)效有絲分裂原，與內(nèi)皮細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合，引起新的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化并形成管腔樣結(jié)構(gòu)；同時(shí)促內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并調(diào)節(jié)纖維蛋白溶酶原的激活因子和抑制因子，在血管生成中對(duì)基底膜細(xì)胞基質(zhì)的降解具有重要作用；此外還可以增加血管通透性，使內(nèi)皮細(xì)胞接受刺激因子的作用增加，同時(shí)血漿外滲，形成血管生成的臨時(shí)基質(zhì)，有利于血管生成，被認(rèn)為是血管生成的先決條件[6]。我們發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組新生血管增生顯著并與VEGF表達(dá)上調(diào)一致，提示DFX通過(guò)誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)而促進(jìn)新生血管形成，這與Langlois等[7]的研究結(jié)果一致。誘導(dǎo)缺氧因子(HIF-1)是缺氧反應(yīng)信號(hào)通路的調(diào)控因子，由HIF-lα和HIF-1β兩個(gè)亞基組成。HIF-lα既是HIF-1調(diào)節(jié)亞基又是活性亞基，缺氧能促進(jìn)HIF-lα表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的HIF-lα和HIF-1β結(jié)合成HIF-1，HIF-1通過(guò)作用于靶基因的缺氧反應(yīng)元件調(diào)控VEGF等靶基因的表達(dá)，在缺氧缺血性組織損傷后的血管生成方面發(fā)揮重要作用。DFX在缺氧條件下能，誘導(dǎo)HIF-1基因表達(dá)，增加HIF-1與DNA結(jié)合活性，促進(jìn)HIF-1α表達(dá)，從而上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)新生血管的形成[8-9]。

DFX用于臨床多年，是一種比較安全有效的藥物，但作用于皮瓣的研究較少，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)張皮瓣局部注射DFX，可以降低自由基水平，加快新生血管形成促進(jìn)皮瓣微循環(huán)重建，從而增加皮瓣存活率，但其最佳作用時(shí)間、劑量及分子機(jī)制上還有待進(jìn)一步研究。

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Experimental study on promoting reconstruction of microcirculation of expanded skin flap with defemxamine.

XU Wei,WANG Chun-mei,YANG Si-fen,DAI Da-mao.
Center of Plastic and Cosmetic Kanghua Hospital of Dongguan, Dongguan 523000,Guangdong,CHINA

Objective To investigate the effects of Deferoxamine(DFX)on the reconstruction of microcirculation of expanded skin flap.MethodsA total of 24 rabbits were divided r andomly into experimental groups and control group.The cylindrical expander was implanted into frontal subcutaneous of the rabbits and rectangular pedicle skin flap was prepared.In the experimental group,the end of the flap was injected with DFX(100 mg/kg)immediately,3rdand 5thdays respectively after the model of preparation;The same dose of normal saline was injected in the control group.On day 7,the mircrovessels was evaluated under the microscope,activity of superoxide dismutase(SOD),content of malondialdehyde(MDA)and VEGF mRNA expression were measured.Result Compared with the control group,SOD activity and Vascular endothelial cell growth factor(VEGF)mRNA expression rised,microvascular density increased(P＜0.05),MDA content and microvascular diamete decreased in the experimental groups(P＜0.05). Conclusion DFX can reduce oxygen free radicals level and accelerate angiogenesis to promote reconstruction of microcirculation of expanded skin flap.

Defemxamine;Expanded skin flap;Malondialdehyde;Superoxide dismutase;Vascular endothelial cell growth factor

R-332

A

1003—6350（2014）09—1259—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.09.0489

2014-02-20)

東莞市科技局科研立項(xiàng)（編號(hào)：20121051059233）

徐 偉。E-mail：xuwei10086@163.com