褐苞蒿揮發(fā)油成分及其抗菌活性研究

周金沙 朱 良 李 樂 鐘菲菲 李 林

ZHOU Jin－sha 1 ZHU Liang 2 LI Le 1 ZHONG Fei－fei 1 LI Lin 1

（1.湖南省食品安全生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410008；2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641）

（1.Food Safety Production Engineering Technology Research Center of Hunan Province，Changshan，Hunan 410013，China；2.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong 510641，China）

蒿屬植物（Artemisia L.）是菊科植物中規(guī)模最大，分布最廣的屬，包括超過500種植物，在地理上分布在歐洲、北美、亞洲和南非的溫帶地區(qū)。在中國分布的約有180余種和44個變種［1］。許多種蒿屬植物是傳統(tǒng)的中國藥用植物，自古以來就用來治療各種疾病，例如瘧疾、肝炎、利尿、高血壓、過敏、青紫、黃疸、癌癥、炎癥以及由微生物引起的感染等［2］。

褐苞蒿（Artemisia phaeolepis Krasch.）是菊科蒿屬的多年生草本植物。主要分布在中國大陸的新疆、內(nèi)蒙古、西藏、青海、寧夏、甘肅、山西以及俄羅斯、蒙古等地，生長于海拔2 500～3 600 m的地區(qū)，一般生長在溝谷、路旁、草地、山坡、林緣灌叢等地區(qū)、荒灘、草甸和礫質(zhì)皮地與半荒漠草原地區(qū)。褐苞蒿具有很強(qiáng)的揮發(fā)性氣味，在傳統(tǒng)的藏藥中，這種草藥用來治療感冒和黃疸型肝炎［3］。目前，國內(nèi)外關(guān)于該植物揮發(fā)油的研究未見報道，鑒于該植物富含揮發(fā)油的特點及原植物全草香氣濃郁，利用水蒸氣蒸餾方法提取褐苞蒿中的揮發(fā)油，對其揮發(fā)油進(jìn)行了分析，并對揮發(fā)油抑菌生物活性進(jìn)行研究，以期為褐苞蒿進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

褐苞蒿全草：于2011年9月收集于中國山西省五臺山。

1.1.2 主要儀器

GC—MS聯(lián)用儀：HP－6890／5973型，美國惠普公司；

高壓滅菌鍋：YXQ－LS－100型，上海涵今儀器儀表有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP－9032型，上海一恒科技有限公司；

超凈操作臺：ATF－1340型，深圳市愛騰來凈化科技公司；

顯微鏡：13395HZX型，上海萊卡顯微鏡系統(tǒng)有限公司。

1.1.3 主要試劑

所用試劑：均為分析純，市售。

1.1.4 供試菌株

大腸埃希氏菌CCTCC AB91112、枯草芽孢桿菌CCTCC AB92068、金黃色葡萄球菌CCTCC AB91053、釀酒酵母CCTCC AY92042和毛霉 CCTCC AF 93209：中國中心菌種保藏中心（CCTCC）。

1.2 試驗方法

1.2.1 精油提取 將褐苞蒿干草粉碎后，稱取1 000 g，裝入5 000 mL圓底燒瓶中，加入3 500 mL蒸餾水，浸泡12 h后，按2010年版《中華人民共和國藥典》中方法［4］，采用水蒸氣蒸餾法提取6 h，得到7.6 g具有特殊氣味的淡黃色油狀液體，出油率為0.76%所得到的油用無水硫酸鈉干燥24 h，過濾，然后在4℃下保存在密封的棕色玻璃瓶中，直到進(jìn)行測試。

1.2.2 氣相色譜條件 色譜柱為 HP－5 MS毛細(xì)管柱（30 m ×0.25 mm i.d.，0.25μm）；程序升溫：從40℃保持1 min，以3℃／min升到250℃，然后保持在250℃下20 min。進(jìn)樣口溫度為250℃；載氣為 He；柱流量為1 m L／min；進(jìn)樣量為0.5μL。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源；電離電壓為70 eV；離子源溫度為230℃，GC—MS接口溫度為260℃；掃描范圍20～450 Amu。

1.2.4 GC／MS分析條件及成分解析 保留指數(shù)RI測定方法是使用C6～C26正構(gòu)烷烴標(biāo)樣，與精油樣品同樣條件下進(jìn)行GC／MS分析。成分解析時，采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫 Wiley（V.7.0）與 NIST （V.2.0）進(jìn)行保留指數(shù) RI核實與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照。成分相對含量采用峰面積歸一化法計算。

1.2.5 生物活性測定

（1）培養(yǎng)基的配制：細(xì)菌培養(yǎng)基是使用 Muller－Hinton肉湯，按照常規(guī)方法制備，滅菌待用；酵母和霉菌培養(yǎng)基是沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，按照常規(guī)方法制備，滅菌待用。所有菌株均在4℃下保存，使用時，細(xì)菌菌株于37℃在Muller－Hinton肉湯中培養(yǎng)24 h；酵母菌株于28℃在沙氏葡萄糖瓊脂中培養(yǎng)48 h；真菌菌株于28℃在沙氏葡萄糖瓊脂中培養(yǎng)120 h。

（2）圓盤擴(kuò)散法：根據(jù)文獻(xiàn)［5］。培養(yǎng)皿中置入20 m L融化并冷卻到45～55℃的培養(yǎng)基，待其凝固成平面后，用移液器吸取0.1 mL制備好的液體菌懸液注入其中并涂布均勻。取滅菌濾紙片（直徑6.0 mm）放置于培養(yǎng)皿中央，用移液器吸取1 000μg的精油注入到濾紙片的正中央后，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h，酵母于28℃培養(yǎng)48 h，真菌于28℃培養(yǎng)120 h測定抑菌圈直徑。取10μg鏈霉素作對照。

（3）最低抑制濃度法（MIC）：根據(jù)文獻(xiàn)［6］。精油的MIC值通過肉湯稀釋法測定。在試管中用培養(yǎng)基制備濃度從0.25～1 000μg／m L的精油稀釋液，再加入0.5 m L供試菌菌懸液。細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h，酵母于28℃培養(yǎng)48 h，真菌于28℃培養(yǎng)120 h測定。

（4）統(tǒng)計分析：所有試驗進(jìn)行了3次平行試驗，并且結(jié)果被計算為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐苞蒿精油化學(xué)成分分析

褐苞蒿精油經(jīng)GC／MS條件分離得到85個組分，結(jié)果見圖1。用面積歸一化方法測定了各峰面積，經(jīng)計算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定了其中65個化合物，占總峰面積的92.7%，分析鑒定結(jié)果見表1。由表1可知，褐苞蒿精油中的主要成分為桉油醇（11.30%），樟腦（8.21%），4－萜烯醇（7.32%），石竹烯氧化物（6.34%），大根香葉烯 D（6.39%）和石竹烯（5.37%）。

圖1 褐苞蒿精油的GC—MS的總離子流圖Figure 1 Total ion current chromatogram of the essential oil from A.Phaeolepis

表1 褐苞蒿精油的化學(xué)成分及含量Table 1 Chemical composition of the essential oil from A.phaeolepis

表1 褐苞蒿精油的化學(xué)成分及含量Table 1 Chemical composition of the essential oil from A.phaeolepis

峰號 保留指數(shù) 化合物 峰面積 鑒定方法1 823 丁酸 0.15 MS，RI 2 854 （E）－2－己烯醛 0.26 MS，RI 3 856 （Z）－－2－甲基－3甲烯基－5－ 烯 0.38 MS，RI 4 867 n－Hexanol正己醇 0.24 MS，RI 5 906 2，5－二甲基－3－乙烯基－1，4－己二烯 1.46 MS，RI 6 922 黏蒿三烯 1.37 MS，RI 7 937 α－蒎烯 1.32 MS，RI 8 973 檜烯 2.06 MS，RI 9 978 β－蒎烯 2.15 MS，RI 10 992 β－月桂烯 1.32 MS，RI 11 996 3，3，6－三甲基－1，4－庚二烯－6－醇 0.68 MS，RI 12 1 005 α－水芹烯 0.35 MS，RI 13 1 030 檸檬烯 2.45 MS，RI 14 1 033 桉油醇 11.30 MS，RI，Co 15 1 064 3，3，6－三甲基－1，5庚二烯－4－酮 0.24 MS，RI 16 1 081 3，3，6－三甲基－2，5庚二烯－4－醇 0.67 MS，RI 17 1 085 3，3，6－三甲基－1，5庚二烯－4－醇 0.65 MS，RI 18 1 098 芳樟醇 1.87 MS，RI 19 1 102 側(cè)柏酮 2.21 MS，RI 20 1 109 脫氫芳樟醇 0.33 MS，RI 21 1 125 菊油環(huán)酮 0.28 MS，RI 22 1 140 （Z）－檜萜醇 1.05 MS，RI 23 1 142 6，6－二甲基－2－亞甲基雙環(huán)［3，1，1］庚－3－醇 1.27 MS，RI 24 1 146 樟腦 8.21 MS，RI，Co 26 1 149 （E）－側(cè)柏醇 0.35 MS，RI 27 1 153 香茅醛 0.44 MS，RI 28 1 162 松香芹酮 0.29 MS，RI 29 1 165 龍腦 3.03 MS，RI 30 1 177 松油烯－4醇 7.32 MS，RI，Co 31 1 191 α－松油醇 1.24 MS，RI 32 1 230 香茅醇 1.26 MS，RI 33 1 242 香芹酮 1.35 MS，RI 34 1 248 （Z）－－3，7－二甲基－2，6－辛二烯－1－醇 1.82 MS，RI 35 1 258 （E）－3，7－二甲基－2，6－辛二烯－1－醇 1.87 MS，RI 36 1 293 側(cè)柏醇乙酯 1.38 MS，RI 37 1 349 α－畢澄茄烯 0.38 MS，RI 38 1 354 乙酸－3，7－二甲基－6－辛烯酯 0.34 MS，RI 39 1 356 丁香酚 0.47 MS，RI 40 1 376 α－可巴烯 0.36 MS，RI 41 1 385 波旁烯 0.53 MS，RI 42 1 388 乙酸香葉酯 0.29 MS，RI 43 1 392 異戊酸苯甲酯 0.37 MS，RI 44 1 408 α－古蕓烯 0.43 MS，RI 45 1 418 石竹烯 5.37 MS，RI，Co 46 1 433 γ－欖香烯 1.36 MS，RI

續(xù)表1

2.2 褐苞蒿精油抑菌生物活性測定

試驗采用圓盤擴(kuò)散法和微量稀釋法測定褐苞蒿精油對供試細(xì)菌的抑制作用。褐苞蒿精油對幾種常見的病菌的抑制效果見表2。由表2可知，在5株供試菌中，褐苞蒿精油對兩株革蘭氏陽性菌（枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌）的抑菌性表現(xiàn)最好，其次為革蘭氏陰性菌（大腸埃希氏菌）。

表2 褐苞蒿精油的抑菌生物活性測定結(jié)果Table 2 Antimicrobial activity of the A.phaeolepis essential oil

從以往文獻(xiàn)可知，多種蒿屬植物，例如Artemisia asiatica［7］，Artemisia douglasiana［8］，Artemisia herba－alba［9］均 具有廣譜的抗菌作用；目前認(rèn)為蒿屬植物的揮發(fā)油成分，例如多種小分子萜及萜氧化物，如樟腦、桉油醇、4－萜烯醇、石竹烯對細(xì)菌的細(xì)胞膜有破壞作用［10，11］。因此，可以認(rèn)為褐苞蒿精油是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果。

3 結(jié)論

本研究從采自山西五臺山的褐苞蒿揮發(fā)油中分離鑒定出65個化學(xué)成分（占總揮發(fā)油的92.70%，其中主要含有結(jié)構(gòu)多樣的單萜、倍半萜類化合物），本試驗結(jié)果與文獻(xiàn)［7－9］報道的來源于其它種的蒿屬植物揮發(fā)油在化合物組成和含量上存在一定差異，究其原因可能與植物的品種或來源地相關(guān)?？咕囼灡砻骱职锞途哂幸欢ǖ膹V譜抗菌能力，尤其對革蘭氏陽性菌具有很好的抑制作用。本試驗開展褐苞蒿精油的化學(xué)成分及抗菌活性研究，試驗結(jié)果可為今后褐苞蒿精油相關(guān)活性的開發(fā)利用提供有效借鑒和科學(xué)依據(jù)。

1 He Z Z，Yan J F，Song Z J，et al.Chemical constituents from the aerial parts of Artemisia minor［J］.Journal of Natural Products，2009，72（6）：1 198～1 201.

2 戴小軍，劉延慶，梅全喜.蒿屬藥用植物藥理活性研究進(jìn)展［J］.中藥材，2005，28（3）：243～247.

3 Tan R X，Wang W Z，Yang L，et al.A new eudesmenoic acid from Artemisia phaeolepis［J］.Journal of Natural Products，1995，58（2）：288～290.

4 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（I部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

5 Zhu L，Tian Y J，Yin Y C，et al.Chemical composition and antimicrobial activities of the essential oils from flowers，leaves and stems of Wedelia urticifolia［J］.Italian Journal of Food Science，2012，24（1）：1～7.

6 Su J Y，Zhu L，Tian Y J.Chemical composition and antimicrobial activities of essential oil of Matricaria songarica［J］.International Journal of Agriculture and Biology，2012，14（1）：107～110.

7 Kalemba D，Kusewicz D，Swiader K.Antimicrobial properties of the essential oil of Artemisia asiatica Nakai［J］.Phytotherapy Research，2002，16（3）：288～291.

8 Setzer W N，Vogler B，Schmidt J M，et al.Antimicrobial activity of Artemisia douglasiana leaf essential oil［J］.Fitoterapia，2004，75（2）：192～200.

9 Mighri H，Hajlaoui H，Akrout A，et al.Antimicrobial and antioxidant activities of Artemisia herba－alba essential oil cultivated in Tunisian arid zone［J］.Comptes Rendus Chimie，2010，13（3）：380～386.

10 Lopes－Lutz D，Alviano D S，Alviano C S，et al.Screening of chemical composition，antimicrobial and antioxidant activities of Artemisia essential oils［J］.Phytochemistry，2008，69（8）：1 732～1 738.

11 Lv F，Liang H，Yuan Q P，et al.In vitro antimicrobial effects and mechanism of action of selected plant essential oil combinations against four food－related microorganisms［J］.Food Research International，2011，44（9）：3 057～3 064.