Nucleophosmin1胞漿表達(dá)的結(jié)腸癌組織中不存在其第12外顯子突變

楊宇峰，張錫迎，楊梅，謝樹瑞，張寶庭

(東莞市石龍人民醫(yī)院病理科，廣東 東莞 523326)

·論著·

Nucleophosmin1胞漿表達(dá)的結(jié)腸癌組織中不存在其第12外顯子突變

楊宇峰，張錫迎，楊梅，謝樹瑞，張寶庭

(東莞市石龍人民醫(yī)院病理科，廣東 東莞 523326)

目的觀察Nucleophosmin1（NPM1）在結(jié)腸癌組織中是否存在NPM1基因第12外顯子突變。方法免疫組化檢測(cè)115例結(jié)腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織、10例結(jié)腸絨毛狀腺瘤、10例管狀腺瘤和10例正常結(jié)腸黏膜組織NPM1表達(dá)；檢查NPM1胞漿表達(dá)的結(jié)腸癌組織中是否存在NPM1基因第12外顯子突變。結(jié)果在115例結(jié)腸癌樣本中有92.1%（106/115）的病例NPM1表達(dá)定位于胞核，7.0%（8/115）的病例存在胞漿NPM1表達(dá)，0.9%(1/115)的病例胞核與胞漿NPM1陰性表達(dá)；NPM1在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，并且明顯高于在相應(yīng)癌旁組織、絨毛狀腺瘤、管狀腺瘤和正常結(jié)腸黏膜組織的表達(dá)(P均<0.05)。結(jié)腸癌組織中NPM1第12外顯子結(jié)構(gòu)與正常黏膜野生型NPM1第12外顯子結(jié)構(gòu)的相似。結(jié)論NPM1在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，表明NPM1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的潛在作用；NPM1胞漿表達(dá)的結(jié)腸癌組織中不存在NPM1基因第12外顯子突變，說明NPM1以未知方式而不是基因突變方式參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。

Nucleophosmin1；結(jié)腸癌；基因突變

Nucleophosmin1(NPM1)是多功能的核仁磷酸蛋白。NPM1基因的第12外顯子突變發(fā)生在35%～40%的急性髓樣白血病(AML)病例中，NPM1突變蛋白在AML特征性胞漿定位[1]與NPM1蛋白在其他惡性腫瘤細(xì)胞的胞核定位顯著不同，臨床統(tǒng)計(jì)分析表明，NPM1的胞漿表達(dá)型/突變型AML病例對(duì)化療敏感且預(yù)后良好，因此，NPM1突變及其表達(dá)蛋白檢測(cè)對(duì)于AML的診斷治療具有重要的臨床意義。然而，在實(shí)體腫瘤中尚未發(fā)現(xiàn)NPM1基因突變和相應(yīng)的突變蛋白胞漿定位。Karhemo等[2]在檢測(cè)1 113例乳腺癌組織樣本發(fā)現(xiàn)分別有42例和36例樣本存在胞漿NPM1低表達(dá)及高表達(dá)。我們?cè)谇捌谘芯恐幸灿^察到在結(jié)腸癌組織中有少量病例免疫組化檢測(cè)到NPM1的胞漿陽性，這與之前研究的NPM1胞核表達(dá)有顯著不同。我們收集結(jié)腸癌組織樣本觀察NPM1蛋白的表達(dá)和定位，檢測(cè)NPM1表達(dá)蛋白與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，分析NPM1基因在結(jié)腸癌中的突變情況，探討NPM1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本及病例收集東莞市石龍人民醫(yī)院2005-2010年有完整臨床和病理檔案資料的結(jié)腸良惡性組織樣本共145例，包括115例結(jié)腸癌及相應(yīng)癌旁組織、10例絨毛狀腺瘤、10例管狀腺瘤和10例正常結(jié)腸黏膜組織，均用于免疫組化檢測(cè)。結(jié)腸病變的診斷根據(jù)最新的WHO病理診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)腸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織、絨毛狀腺瘤、管狀腺瘤和正常結(jié)腸黏膜組織的石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、微波修復(fù)抗原，孵育鼠單克隆一抗NPM1(克隆號(hào)NA24，Santa Cruz Biotechnology，美國)，DAB顯色，蘇木素對(duì)比染色，觀察NPM1陽性染色的部位及強(qiáng)度。每批染色均設(shè)置陽性、陰性對(duì)照。分別用預(yù)實(shí)驗(yàn)中已知NPM1陽性結(jié)腸癌組織切片為陽性對(duì)照；用PBS緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照。采用半定量積分法判斷結(jié)果，陽性細(xì)胞計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色強(qiáng)度分級(jí)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：淡黃色為1分；黃或深黃色為2分；褐或棕褐色為3分。兩者計(jì)分相乘綜合判斷表達(dá)強(qiáng)度，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 抽提NPM1胞漿陽性表達(dá)的結(jié)腸癌組織DNADNA抽提采用以前文獻(xiàn)所述DNA抽提方法[3]，除極少數(shù)病例外，NPM1基因在第12外顯子常存在突變。因此我們分析了NPM1第12外顯子編碼區(qū)域。首先擴(kuò)增NPM1胞漿陽性表達(dá)的結(jié)腸癌和正常黏膜細(xì)胞的第12外顯子。引物序列如下：上游引物5'-tctatgaagtgttgtggttc-3'和下游引物5'-ctgcattataaaaaggacag-3'。PCR產(chǎn)物的大小是179個(gè)堿基對(duì)。PCR過程參照相關(guān)文獻(xiàn)描述[4]。PCR產(chǎn)物的測(cè)序使用測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer,Foster City，CA)，測(cè)序方法遵循試劑說明書的建議。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，包括PCR和測(cè)序分析，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。χ2檢驗(yàn)檢測(cè)NPM1在結(jié)腸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織、絨毛狀腺瘤、管狀腺瘤和正常結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)差異，也檢測(cè)NPM1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPM1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示在115例結(jié)腸癌樣本中有92.1%(106/115)的病例NPM1表達(dá)定位于胞核，7.0%(8/115)的病例存在胞漿NPM1表達(dá)，0.9%(1/115)的病例胞核與胞漿NPM1陰性表達(dá)(圖1)。在107例NPM1非胞漿表達(dá)的結(jié)腸癌組織中強(qiáng)陽性28例(26.2%)，陽性34例(31.8%)，弱陽性44例(41.1%)，陰性1例(0.9%)。結(jié)腸癌組織中的間質(zhì)及癌旁上皮組織中也表達(dá)。在10例結(jié)腸絨毛狀腺瘤、10例管狀腺瘤和10例正常結(jié)腸黏膜組織中，NPM1表達(dá)陽性率分別為40%(4/10)、30%(3/10)、0 (0/10)。統(tǒng)計(jì)顯示NPM1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)與在相應(yīng)癌旁組織、絨毛狀腺瘤、管狀腺瘤和正常結(jié)腸黏膜組織的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在結(jié)腸癌組織的表達(dá)明顯高于在相應(yīng)癌旁組織、絨毛狀腺瘤、管狀腺瘤和正常結(jié)腸黏膜組織的表達(dá)(P<0.05)，見表1。

圖1 NPM1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

表1 NPM1蛋白在五組結(jié)腸組織中的表達(dá)（例）

2.2 NPM1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系我們根據(jù)不同臨床病理參數(shù)分組比較NPM1表達(dá)差異。在107例NPM1非胞漿表達(dá)的結(jié)腸癌病例中，NPM1表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)腸癌患者TNM分期和腫瘤組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NPM1陽性表達(dá)結(jié)腸癌患者可能有更高的TNM分期或更低的組織學(xué)分級(jí)。NPM1表達(dá)與患者年齡、性別及腫瘤組織學(xué)類型無明顯相關(guān)性，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 NPM1在結(jié)腸癌的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（例）

2.3 NPM1胞漿表達(dá)結(jié)腸癌組織第12外顯子突變情況我們分析了7例NPM1胞漿陽性表達(dá)的結(jié)腸癌組織和7例正常黏膜組織NPM1基因第12外顯子突變情況。結(jié)腸癌組織中NPM1第12外顯子結(jié)構(gòu)與正常黏膜野生型NPM1第12外顯子結(jié)構(gòu)相似。因此沒有證據(jù)表明在NPM1胞漿陽性表達(dá)的結(jié)腸癌組織存在NPM1第12外顯子突變，我們重復(fù)了這個(gè)實(shí)驗(yàn)兩次以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性,并且兩次結(jié)果是一致的。

3 討論

在這項(xiàng)研究中我們的數(shù)據(jù)表明NPM1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于在相應(yīng)癌旁組織、絨毛狀腺瘤、管狀腺瘤和正常腸黏膜組織中的表達(dá)。這些結(jié)果表明NPM1的高表達(dá)在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

NPM1是一種多功能的細(xì)胞磷酸化的穿梭蛋白，它參與核糖體的生物合成、調(diào)控中心體復(fù)制、參與細(xì)胞凋亡調(diào)控、并具有分子伴侶功能[5]。NPM1在腫瘤形成過程中的作用是有爭(zhēng)議的。一方面，以往的研究報(bào)道NPM1在許多實(shí)體腫瘤高表達(dá)[6]，如肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌和甲狀腺癌。這些結(jié)果包括我們的結(jié)果表明NPM1在惡性腫瘤形成過程中的起癌基因的作用。NPM1基因突變或重排也見于血液腫瘤[7]，這也表明NPM1起癌基因的作用。但是，在實(shí)體腫瘤中沒有發(fā)現(xiàn)NPM1基因突變[8]。此外，剔除NPM1基因可降低細(xì)胞生存能力，導(dǎo)致細(xì)胞衰老和細(xì)胞周期阻滯，這也在功能上支持它作為一個(gè)癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。

另一方面，以剔除NPM1基因的細(xì)胞和攜帶一個(gè)NPM1失活位點(diǎn)等位基因的老鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究則顯示出NPM1的腫瘤抑制功能[10]。此外，在乳腺癌中也報(bào)道NPM1的腫瘤抑制功能[2]。盡管NPM1似乎通過許多機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但是它的具體作用機(jī)制尚不清楚。NPM1可能作為癌基因和抑制基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表研究報(bào)告：NPM1突變及其突變蛋白特征性胞漿定位檢測(cè)在AML的臨床診治及預(yù)測(cè)預(yù)后中具有重要價(jià)值[1]；Nature Review Cancer[5]和Blood[11]雜志先后發(fā)表綜述文章重點(diǎn)介紹NPM1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和意義。(1)人NPM1/B23基因定位于5q35，含有12個(gè)外顯子，編碼蛋白可分為B23.1、B23.2和B23.3等3種亞型，NPM1(B23.1)蛋白是功能較為廣泛且被研究較多的亞型，由294個(gè)氨基酸構(gòu)成，含有多種功能結(jié)構(gòu)域[12]，其主要定位于核仁，當(dāng)細(xì)胞受到外部刺激或進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)的時(shí)候，NPM1蛋白可穿梭于核仁-核漿-胞漿，在核糖體合成及運(yùn)輸、與其他蛋白相互作用、維持染色體組穩(wěn)定和調(diào)節(jié)中心體復(fù)制中發(fā)揮重要作用，因此，NPM1是細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控的重要因子。(2)惡性腫瘤中存在NPM1基因遺傳學(xué)改變，幾種淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中檢測(cè)到NPM1基因突變和移位[13-15]：35%～40%的AML病例發(fā)現(xiàn)NPM1基因的12外顯子突變，突變的NPM1基因編碼異常蛋白質(zhì)，其C-末端包含突變的色氨酸位點(diǎn)[1]，從而獲得一個(gè)核輸出信號(hào)[16]。其突變蛋白特征性定位在腫瘤細(xì)胞胞漿；免疫組化檢測(cè)到NPM1的胞漿陽性表達(dá)可以用于預(yù)測(cè)NPM1的基因突變；進(jìn)而發(fā)現(xiàn)NPM1胞漿型AML對(duì)化療敏感及預(yù)后良好。大約85%的CD30陽性間變大細(xì)胞性淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)基因移位t(2；5)(p23；q35)，NPM1基因與ALK基因“融合”形成NPM1-ALK融合基因和編碼融合蛋白，并發(fā)現(xiàn)此融合蛋白具有致瘤作用[17]。然而，有趣的是，在非淋巴造血系統(tǒng)腫瘤或者是實(shí)體瘤中尚未檢測(cè)到NPM1基因突變和移位。

我們免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)少量結(jié)腸癌樣本存在NPM1胞漿表達(dá)，因此進(jìn)一步檢測(cè)NPM1胞漿表達(dá)的結(jié)腸癌組織中是否存在NPM1基因第12外顯子突變。結(jié)果顯示在這些免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的NPM1胞漿陽性結(jié)腸癌組織中不存在NPM1基因第12外顯子突變。這可能表明NPM1基因第12外顯子突變很少發(fā)生在結(jié)腸癌，并且NPM1基因第12外顯子突變可能在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中不發(fā)揮重要作用。

總之，NPM1在結(jié)腸癌組織中的高表達(dá)說明NPM1在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。NPM1胞漿陽性結(jié)腸癌組織中不存在NPM1基因第12外顯子突變。這可能表明NPM1基因以未知方式而不是基因突變方式參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。當(dāng)然，我們需要進(jìn)一步研究NPM1基因致結(jié)腸癌發(fā)生的機(jī)制。

(感謝華南腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)腫瘤防治中心張志義博士技術(shù)指導(dǎo)。)

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Non-presence of mutations in exon 12 of nucleophosmin1(NPM1)gene in colorectal carcinomas with NPM1 expression in cytoplasm.

YANG Yu-feng,ZHANG Xi-ying,YANG Mei,XIE Shu-rui,ZHANG Bao-ting.Department of Pathology,Dongguan Shilong Peole's Hospital,Dongguan 523326,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate whether there is a presence of mutations in exon 12 of nucleophosmin1 (NPM1)gene in colorectal carcinomas(CRC).MethodsWe investigated NPM expression by immunohistochemistry in histologically normal to malignant colorectal tissues and also investigate whether exon 12 of the NPM1 gene is mutated in CRC with NPM expression located in cytoplasm.ResultsAmong the 115 samples of colorectal carcinomas,92.1%(106/115)of the tumors showed NPM1-positive expression only in the nucleus,7.0%(8/115)showed NPM1-positive expression in cytoplasm,and 0.9%(1/115)showed NPM1-negative expression in cytoplasm and nucleus.NPM expression was found significantly up-regulated in CRC compared to adjacent colorectal tissue,villous adenoma,tubular adenoma and normal colorectal tissues,respectively(P<0.05 for all).Sequencing of exon 12 of NPM1 gene in CRC was the same as those in normal colorectal tissue.ConclusionNPM expression is found significantly up-regulated in CRC,suggesting that NPM contributes to oncogenesis of CRC.However,NPM1 exon 12 is not mutated in CRC,which suggests that NPM1 play a role in the tumorigenesis of CRC through unclear mechanisms rather than NPM1 mutation.

Nucleophosmin1;Colon carcinomas;Gene mutation

R735.3+5

A

1003—6350（2014）07—0950—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.07.0369

2013-12-30)

東莞市科技計(jì)劃醫(yī)療衛(wèi)生類科研一般項(xiàng)目(編號(hào)：20131051010064)

楊宇峰。E-mail:y313yang260@163.com