黃蜀葵中活性成分含量測定

李 永，葛兆宏，段瓊輝，于生蘭，李勇軍，談祥宇，王 丹

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

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黃蜀葵中活性成分含量測定

李 永，葛兆宏*，段瓊輝，于生蘭，李勇軍，談祥宇，王 丹

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

目的：測定黃蜀葵中主要活性成分的含量。方法：采用硫酸-苯酚法測定多糖的含量，采用分光光度法測定總黃酮的含量，采用HPLC法測定槲皮素和金絲桃苷的含量。結(jié)果：黃蜀葵中多糖含量為5.68%，總黃酮含量為1.577 5%，金絲桃苷和槲皮素含量分別為1.102%、0.404 1%。結(jié)論：黃蜀葵中多糖、總黃酮、金絲桃苷、槲皮素等活性成分含量較高，所選的相應(yīng)測定方法簡便，結(jié)果可靠，可作為其質(zhì)量控制參考。

黃蜀葵；活性成分；含量測定；金絲桃苷；槲皮素；多糖；總黃酮

黃蜀葵始載于《嘉佑本草》，資源豐富，藥用歷史十分悠久，在民間常用于治療疔瘡、腮腺炎、肺熱咳嗽等，其根、莖、葉、花及種子等均可入藥，藥用最多的部位為花[1]。黃蜀葵花為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschusmanihot(L.)Medic.的干燥花冠，夏、秋兩季花開時(shí)采摘，及時(shí)干燥即得。其性甘、寒，歸腎、膀胱經(jīng)，具有清利濕熱、消腫解毒的功效，臨床用于濕熱壅遏、淋濁水等癥的治療，外治癰疽腫毒、水火燙傷等[2]?，F(xiàn)代研究表明，黃蜀葵的主要化學(xué)成分為金絲桃苷等黃酮類和多糖類成分，對(duì)腎炎、心肌損傷、腦缺血損傷等具有較好的治療效果[3-5]。江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司以黃蜀葵花為主要原料，生產(chǎn)研制的三類新藥“黃葵膠囊”已經(jīng)上市，用于治療腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。該藥療效確切，市場前景看好，大力促進(jìn)了江蘇省泰州市黃蜀葵種植業(yè)的蓬勃發(fā)展，目前在泰州市興化、泰興、姜堰、高港等不同地區(qū)均有農(nóng)戶種植。為合理科學(xué)地評(píng)價(jià)黃蜀葵藥材的質(zhì)量，筆者分別采用分光光度法和高效液相色譜法對(duì)泰州市黃蜀葵花中的活性成分含量進(jìn)行了測定，以期為該藥材的質(zhì)量控制方法提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：LC-20A高效液相色譜儀(日本島津，SPD-21A型紫外檢測器，N2000 色譜工作站)；UNIC 3802雙波長紫外-可見分光光度計(jì)；IKA HB10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī)；BP211D電子天平。

1.2 試藥

硫酸、苯酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸、乙醇等試劑均為分析純；市售金絲桃苷(批號(hào)：111521-201205)對(duì)照品、槲皮素(100081-200907)對(duì)照品；無水葡萄糖(批號(hào)：110833-201205)；蘆丁(CEGP-4L70)購自中國食品藥品檢定研究院；高效液相所用乙腈為色譜純，水為超純水(自制)。

黃蜀葵花藥材采收自泰州地區(qū)黃蜀葵種植戶，經(jīng)江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院李勇軍副教授鑒定為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschusmanihot(L.)Medic.的干燥花冠和花萼。藥材經(jīng)低溫干燥后，粉碎，過篩，得干燥粉末，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃蜀葵花中多糖含量測定[6]

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 精確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(0.1mg/mL)0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL及1.0mL置于容量瓶內(nèi)，加入相應(yīng)量的蒸餾水補(bǔ)至2.0mL，然后加入50g/L苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，迅速搖勻，置于沸水浴中5min，后取出冷卻至室溫。于485nm波長下測定吸光值，以2.0mL水按同樣顯色操作作為空白。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=15.63X-0.006，r=0.999 5。結(jié)果表明葡萄糖在0.01～0.05mg/mL濃度范圍內(nèi)與其吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 樣品溶液制備 稱取黃蜀葵花粉末適量，置于50mL容量瓶中，加水40mL左右，于沸水浴上加熱2h，冷卻至室溫后補(bǔ)加水至刻度，混勻后，過濾，棄去初濾液，收集余下濾液供沉淀多糖用。準(zhǔn)確吸取濾液5mL，至于50mL離心管中，加無水乙醇20mL，混勻，靜置5min，以3 000r/min離心20min。棄去上清液，殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?5mL，即得。

2.1.3 樣品含量測定 取0.5mL樣品溶液置于容量瓶中，以蒸餾水補(bǔ)至2.0mL，然后加入50g/L苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，迅速搖勻，置于沸水浴中5min，取出后流水中冷卻5min至室溫。于485nm波長處測定吸光值，將吸光度值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出黃蜀葵花中多糖含量為5.68%。

2.2 黃蜀葵花中總黃酮含量測定[7]

2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，置于試管中，加水至6mL，加1mL 5%NaNO2溶液，搖勻靜置6min，再加1mL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻靜置6min，加氫氧化鈉試液10mL，加水定容至25mL。以相應(yīng)試劑為空白，靜置15min后于510nm處測定吸光值A(chǔ)，以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=3.495X-0.016，r=0.999。結(jié)果表明蘆丁在0.036 17～0.180 83mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積積分呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 樣品溶液制備 稱取黃蜀葵藥材樣品約1g，加75%甲醇50mL，超聲提取30min，過濾，殘?jiān)貜?fù)提取1次，過濾，合并兩次濾液置于水浴上蒸干，用甲醇溶解定容至25mL，過濾，備用。

2.2.3 樣品含量測定 準(zhǔn)確吸取樣品溶液2mL，按上述硝酸鋁法測定吸光度值，設(shè)置自身對(duì)照，進(jìn)行測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃蜀葵中總黃酮的含量，結(jié)果得黃蜀葵花中總黃酮含量為1.577 5%。

2.3 黃蜀葵花中槲皮素和金絲桃苷含量測定[8-9]

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)；洗脫條件：梯度洗脫:0～40min，體積分?jǐn)?shù)A10%～15%；40～60min，體積分?jǐn)?shù)A15%～40%；檢測波長：360nm；柱溫：室溫；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL。理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3 000。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取金絲桃苷對(duì)照品12.59mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ；精密稱取槲皮素對(duì)照品12.76mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ1mL、對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ1mL于5mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作為混合對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。

2.3.3 供試品溶液制備 取已經(jīng)過60目篩的黃蜀葵藥材粉末1g，精密稱定，置于250mL錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇約150mL，超聲提取30min，放至室溫，轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容，振搖均勻，取適量溶液離心10min(12 000r/min)，取上清液作為供試品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，依次用甲醇稀釋定容至1.0mL，分別精密吸取20μL溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，測定金絲桃苷和槲皮素峰面積。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得金絲桃苷回歸方程Y=452.66X+232.46，r=0.999 6；槲皮素回歸方程Y=474.93X+134.45，r=0.999 8。結(jié)果表明金絲桃苷在5.036～50.36μg/mL，槲皮素在5.104～51.04μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與各自峰面積積分呈良好的線性關(guān)系。

圖1 混標(biāo)HPLC色譜

注：1.金絲桃苷；2.槲皮素

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知金絲桃苷和槲皮素含量的樣品6份，分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按照“樣品含量測定”項(xiàng)下方法測定，計(jì)算加樣回收率，測得金絲桃苷和槲皮素平均回收率分別為101.17%和100.08%，RSD分別為1.79%和0.59%。表明該測定方法符合要求。

2.3.6 樣品中金絲桃苷和槲皮素含量測定 分別按“供試品溶液制備”方法處理樣品各3份，精密吸取供試品溶液20μL，注入高效液相色譜儀測定，將所得峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品中金絲桃苷和槲皮素的含量分別為1.102%、0.404 1%。見圖2。

圖2 黃蜀葵花樣品HPLC色譜

注：1.金絲桃苷；2.槲皮素

3 討論

黃蜀葵在我國歷代醫(yī)籍中均有記載，民間使用亦很普遍。黃蜀葵全身都是寶，其莖皮纖維可替代麻制造人造棉；種子、根和花可入藥，具有清熱解毒、涼血、消腫等功效，根主要含有黏液質(zhì)、淀粉和糖類等化學(xué)成分?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)黃蜀葵花中化學(xué)成分的報(bào)道較少，且主要集中在以金絲桃苷和槲皮素為代表的黃酮類成分上，對(duì)其多糖類成分的報(bào)道更少。多糖作為一種具有廣泛藥理活性的大分子物質(zhì)，越來越受到關(guān)注，而硫酸-苯酚法是較為理想的多糖含量測定方法，因此筆者采用該法對(duì)黃蜀葵花中的多糖含量進(jìn)行了測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃蜀葵中總多糖含量為5.68%。

本試驗(yàn)測定結(jié)果表明，黃蜀葵花中總黃酮含量為1.577 5%，而金絲桃苷和槲皮素含量分別為1.102%、0.404 1%，兩者含量加和略低于總黃酮含量，究其原因可能與總黃酮測定方法有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測定總黃酮時(shí)，槲皮素-3'-葡萄糖苷、棉皮素-3'-葡萄糖苷和楊梅素這三種黃酮類化合物不顯色。因此在510nm處測定黃蜀葵花藥材中總黃酮含量時(shí)，這3種成分的含量就沒有計(jì)入總黃酮含量中，且黃蜀葵花中槲皮素-3'-葡萄糖苷含量較高，因此采用該法測得的總黃酮含量略低。

綜上所述，黃蜀葵中多糖、總黃酮、金絲桃苷、槲皮素等活性成分含量較高，本研究所選的相應(yīng)測定方法簡便，結(jié)果可靠，可作為其質(zhì)量控制參考。

[1] 居文政.黃蜀葵的本草考證[J]. 時(shí)珍國藥研究,1994,5(2):6-7.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].第1部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:287.

[3] 譚業(yè)華,陳珍,顧種宜.中草藥黃蜀葵的研究現(xiàn)狀與展望[J].海南師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,19(2):163-167.

[4] 楊靜,李爽,錢芳,等.響應(yīng)面法優(yōu)選黃蜀葵花多糖的提取工藝[J].中國藥房,2013,24(39):3688-3690.

[5] 劉爽,江蔚新,吳斌.黃蜀葵化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥,2010,12(8):5.

[6] 白虹.保健食品功效成分檢測方法[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2011:73-75.

[7] 許海順,蔣劍平,徐攀,等.白花蛇舌草不同萃取物的抗氧化作用研究[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,29(2):48-51.

[8] 徐柏頤,談獻(xiàn)和,朱華云,等.黃蜀葵花HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材,2011,34(6):888-890.

[9] 劉霖,唐海濤,劉漢清,等.黃葵膠囊中5種黃酮類成分的含量測定及其特征圖譜研究[J].中藥材,2013,36(1):132-136.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Content Determination of Active Constituents in Abelmoschi Corolla

Li Yong,Ge Zhaohong,Duan Qionghui,Yu Shenglan,Li Yongjun,Tan Xiangyu,Wang Dan

(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300,China)

To determine the content of active constituents in Abelmoschi corolla.Methods:The phenolμsulfuric acid method was employed to determine the content of polysaccharide,the method of spectrophotometry was employed to determine the content of total flavonoids and the HPLC was used to determine the content of hyperfine and quercetin.Results: The content of polysaccharide in Abelmoschi corolla. is 5.68%,The content of total flavonoids in Abelmoschi corolla. is 1.577 5%,The content of hyperfine in Abelmoschi corolla. is 1.102%,The content of quercetin in Abelmoschi corolla. is 0.4041%. Conclusions:The content of active constituents in Abelmoschi corolla. is higher.The methods are simple and can be adopted for the quality control of Abelmoschi corolla.

Abelmoschi Corolla;Active Constituents;Content Determination;Hyperfine;Quercetin;Polysaccharide;Total Flavonoids

2014-09-17

江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201312806023X，201412806028X)

李永(1980-)，男，江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院講師，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)教育教學(xué)與科研。

葛兆宏(1954-)，男，江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院教授。

R284.1

A

1673-2197(2014)22-0016-03