多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選連芩軟膏的提取工藝

劉堅(jiān)初 ，林 麗 ，強(qiáng) 姣 ，童國勇

（1.廣東省中山市黃圃人民醫(yī)院，廣東 中山 528429； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006）

連芩軟膏是黃圃人民醫(yī)院與廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心共同開發(fā)的新制劑，具有清熱解毒、消腫止痛、斂瘡生肌的功效，臨床主要用于各型痤瘡及痤瘡感染。組方中君藥黃連臨床用于癰腫瘡毒及皮膚濕瘡，也可制膏外用，常與黃芩、黃柏等配伍，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，有效成分為鹽酸小檗堿[1-2]。鹽酸小檗堿易溶于乙醇[3]，為避免其在黃連煎煮、濃縮過程中的損失，大生產(chǎn)多采用滲漉法作為黃連中鹽酸小檗堿的最佳提取方式[4]。2010年版《中國藥典（一部）》收載的黃連成方制劑多采用醇提工藝，如隆清片、香附片、左金膠囊等。另外，臣藥黃芩的乙醇提取物也具有抗菌、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛等作用[5]。為此，本研究中采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選了連芩軟膏的乙醇滲漉提取工藝參數(shù)，旨在為制劑的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀，包括ΜV檢測器、LC-20AT泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、Labsolution色譜工作站；CP225D型萬分之一分析天平（Mettler Toledo）；AB2004-N型十萬分之一分析天平（Mettler Toledo）。黃芩苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110715-201016）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為110322）；色譜甲醇購自Merck公司，水為自制超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷及鹽酸小檗堿的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Kromasil C18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相:甲醇（A）-0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脫，0～20 min 時(shí) 40%A，20～30 min時(shí) 40% ～50%A，30～40 min時(shí)50%A，40～45 min時(shí) 55% ～40%A，45～50 min時(shí) 40%A；流速:1.0 mL /min；檢測波長:黃芩苷280 nm，鹽酸小檗堿345 nm；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:10μL。在此色譜條件下，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

稱取黃芩苷對(duì)照品 2.44 mg、鹽酸小檗堿對(duì)照品4.94 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液；精密量取黃芩苷貯備液和鹽酸小檗堿貯備液各1.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液（含黃芩苷 0.0244 g/L、鹽酸小檗堿 0.049 g /L）。按處方比例稱取全方藥材，粉碎成粗粉，裝入滲漉裝置，少量70%乙醇浸潤24 h后，用10倍量的70%乙醇進(jìn)行滲漉，滲漉速率為6mL/（min·kg），收集滲漉液，置500 mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品原液；精密量取供試品原液1.0 mL，置10mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按處方比例稱取除黃芩外的全方藥材，或除黃連、黃柏和黃藤外的全方藥材，分別按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按2.1.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0，2，4，8，12，16，20 μL，注入色譜儀測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）、對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程黃芩苷為 Y＝3 323 939.496 5X+1 558.846 4（r＝ 1.000 0）；鹽酸小檗堿為 Y＝3 563 917.535 7X-3 261.402 7（r＝1.000 0）。結(jié)果表明，黃芩苷與鹽酸小檗堿的進(jìn)樣質(zhì)量分別在0.204 8～2.048 0μg和 0.216 0～2.160μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。另外，本研究中所建立的含量測定方法已于前期進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明，該方法合理、可行。

2.2 浸膏得率的測定

精密量取供試品原液100mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥至恒重，精密稱定，計(jì)算浸膏得率。

2.3 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):在確定乙醇滲漉工藝路線基礎(chǔ)上，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度（因素A）、溶劑用量（因素 B）、藥材粉碎粒度（因素 C）及滲漉速率（因素D）為考察因素，因素水平見表1。

表1 因素水平表

正交優(yōu)選試驗(yàn):按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，提取效果以君藥黃連、臣藥黃芩中有效成分鹽酸小檗堿、黃芩苷的提取率(指標(biāo)Ⅰ，指標(biāo)Ⅱ)和組方的浸膏得率(指標(biāo)Ⅲ)為指標(biāo)，提取率（%）＝黃芩苷得率/藥材中黃芩苷含量×100%。并按照鹽酸小檗堿0.42、黃芩苷0.18、浸膏得率0.4的權(quán)重系數(shù)對(duì)其進(jìn)行加權(quán)評(píng)分，分別填于正交設(shè)計(jì)軟件，進(jìn)行直觀分析。方差分析，結(jié)果見表2及表3。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

結(jié)果分析:由表2中 R值可知，乙醇濃度、粉碎粒度是影響滲漉工藝提取效果的主要因素，溶劑用量、滲漉速率次之。方差分析（表3）結(jié)果顯示，因素A及C對(duì)滲漉工藝中鹽酸小檗堿、黃芩苷的提取率和浸膏得率的影響有顯著性。結(jié)合極差分析結(jié)果及低耗高效原則，確定連芩軟膏最佳滲漉工藝條件為A2B3C2D3，即處方藥材粉碎成粗粉，加12倍量70%乙醇進(jìn)行滲漉，滲漉速率為 9 mL /（min·kg）。

2.4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按最佳滲漉工藝條件A2B3C2D3進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表4?？梢?，該工藝合理，穩(wěn)定可行。

3 討論

鹽酸小檗堿及黃芩苷的抗炎、抗菌藥效作用提示，本制劑滲漉工藝正交試驗(yàn)選取君藥黃連中鹽酸小檗堿及臣藥中黃芩苷的提取率作為考察指標(biāo)之一，具有合理性。另外，本試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，組方中除去君藥黃連外，黃柏、黃藤同樣含有鹽酸小檗堿（以鹽酸小檗堿計(jì)，黃連中含量為6.08%，黃柏中含量為3.55%，黃藤中含量為2.54%）。為避免試驗(yàn)差錯(cuò)，故制備了缺黃連、黃柏、黃藤的陰性樣品考察鹽酸小檗堿的專屬性，同時(shí)將黃柏、黃藤藥材也作為綜合評(píng)分的權(quán)重系數(shù)之一。因此，本試驗(yàn)中給予鹽酸小檗堿及黃芩苷權(quán)重系數(shù)分別為0.42和0.18，以及浸膏得率的權(quán)重系數(shù)為0.4，進(jìn)行綜合評(píng)分。若能加之藥理試驗(yàn)，對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，則所優(yōu)選工藝更顯合理性。

表4 最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)

參考文獻(xiàn):

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