泊那替尼原料藥兩種含量測(cè)定方法比較

熊遠(yuǎn)果，張 洪，齊 倩

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060）

泊那替尼（ponatinib）是第 3代酪氨酸酶抑制劑（TKI），對(duì)費(fèi)城染色體上的bcr-abl融合基因有很強(qiáng)的抑制作用，是目前唯一能作用于T315I突變型的藥物[1-3]。泊那替尼主要用于兩種耐藥的白血病，即慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）和費(fèi)城染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞白血?。≒h+ALL）成年患者[4-5]。2012年12月，美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)泊那替尼作為對(duì)第1代酪氨酸酶抑制劑伊馬替尼和第2代酪氨酸酶抑制劑達(dá)沙替尼或尼洛替尼抵抗或耐受的治療藥物[6-8]。泊那替尼化學(xué)名為3-（2-咪唑[1，2-b]噠嗪-3-乙炔）-4-甲基 -N-[4-[（4-甲基 -1-哌嗪）甲基]-3-（三氟甲基）苯基]苯甲酰胺，分子式為C29H27F3N6O，相對(duì)分子質(zhì)量為532.56。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見泊那替尼原料藥含量的檢測(cè)方法報(bào)道，缺乏相應(yīng)的檢測(cè)方法學(xué)參考。為此，本試驗(yàn)中建立了測(cè)定泊那替尼原料藥含量的高效液相色譜（HPLC）法，可快速準(zhǔn)確測(cè)定泊那替尼含量；同時(shí)，對(duì)比紫外分光光度（UV）法的測(cè)定結(jié)果，旨在優(yōu)選最佳分析方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀（配四元梯度泵，DAD檢測(cè)器，G137PA型自動(dòng)脫氣機(jī)，標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，色譜工作站）；SK5200H型超聲波清洗儀 （上海科密斯超聲波清洗儀器有限公司）；Model PH-25 Mater（上海科學(xué)儀器有限公司）；UV-2800型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼克＜上海＞儀器有限公司）；TG328A型電子分析天平（上海天平儀器廠）。泊那替尼原料藥（上海翰香生化制品有限公司，批號(hào)為20121226，20121230，20130115）；泊那替尼對(duì)照品（NCE Bbiomedical Co.Ltd，批號(hào)為06771）；甲醇（HPLC 純，美國天地有限公司）；乙腈（HPLC 純，美國天地有限公司）；乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定

2.1.1 色譜條件

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)優(yōu)化確定。色譜柱:Agilent Zorbax Extend C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈 -0.2% 三乙胺緩沖液（85 ∶15）；流速:1.0 mL /min；檢測(cè)波長:280 nm；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:20μL。

2.1.2 溶液制備

在 2.1.1 項(xiàng)條件下，配制 0.2% 的三乙胺（pH ＝10.95）緩沖液，確定流動(dòng)相為乙腈 -0.2% 三乙胺緩沖液（85 ∶15，V ∶V），經(jīng)0.45 mm微孔過濾，超聲后靜置，作為陰性對(duì)照品溶液。取泊那替尼原料藥（批號(hào)為 20121226）適量，精密稱定，置 10 mL容量瓶中，并用無水乙醇溶解，超聲30 min，并稀釋至刻度，即得供試品溶液。精密稱取泊那替尼對(duì)照品1mg，置10mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，超聲，并稀釋至刻度，即制得100μg/mL的對(duì)照品溶液(貯備液)。對(duì)照品溶液和供試品溶液均于4℃保存。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按擬訂的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:將對(duì)照品貯備液用無水乙醇配制成質(zhì)量濃度為 1，5，10，15，20，25，30，35，40 μg /mL 的對(duì)照品溶液，按 2.1.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣量20μL，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。以5次測(cè)定的泊那替尼峰面積平均值（A）對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量濃度（μg/mL）作線性回歸，線性回歸方程為 A＝42.501C+3.328 2，r＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，泊那替尼檢測(cè)質(zhì)量濃度在 1～40μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取適量泊那替尼對(duì)照品，精密稱定，配制成高、中、低（10，20，30 μg/mL）3 種不同質(zhì)量濃度的溶液，分別在 1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，每次測(cè)定3次，記錄色譜峰面積，取峰面積平均值（A）計(jì)算 日內(nèi)精 密度 ，結(jié)果 RSD分別為 0.20% ，0.09% ，0.19%（n＝5）。連續(xù) 5 d進(jìn)樣，3種溶液每天測(cè)定 1次，每次測(cè)定樣品5次，取峰面積平均值（A）計(jì)算日間精密度，結(jié)果 RSD為0.05%，0.10% ，0.90% （n ＝ 5）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取泊那替尼原料藥適量，配制成10μg/mL 的供試品溶液，分別加入 5，15，25μg/mL 的對(duì)照品溶液，超聲混勻，作為50%，150%，250%的加樣溶液。按擬訂的色譜條件進(jìn)樣，以5次測(cè)定的峰面積平均值（A）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1?？梢?，擬訂的方法滿足藥物質(zhì)量分析要求[13]。

表1 泊那替尼加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

穩(wěn)定性試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為40μg/mL的供試品溶液，在室溫條件下貯存，分別于0，4，8，12 h時(shí)按擬訂的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果泊那替尼峰面積平均值的 RSD為 0.18%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）確定:精密稱定泊那替尼對(duì)照品適量，按2.1.2項(xiàng)下方法配制不同質(zhì)量溶度的對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定。信噪比等于 3時(shí)，最低檢測(cè)限0.049μg/mL，RSD＝1.20% （n＝5）；信噪比等于 10 時(shí)，最低定量限 0.163 μg/mL，RSD ＝1.43%（n＝5）。

2.1.4 樣品含量測(cè)定

分別精密稱取3種不同批號(hào)的泊那替尼原料藥1mg，分別置3個(gè)10mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，超聲30 min，并稀釋至刻度，取適量，用無水乙醇稀釋至20μg/mL，按擬訂的色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)定5次，以5次測(cè)定泊那替尼的峰面積平均值（A）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算含量（n＝3）。結(jié)果見表2。

表2 泊那替尼原料藥兩種方法含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

2.2 紫外分光光度（UV）法測(cè)定

2.2.1 檢測(cè)波長選擇

稱取泊那替尼對(duì)照品10mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，并用無水乙醇定容，搖勻，即得泊那替尼對(duì)照品溶液。用無水乙醇稀釋至適量濃度，以空白無水乙醇溶液作參比，于190～800 nm全波長范圍內(nèi)掃描。掃描結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，泊那替尼有多個(gè)吸收峰，考慮到溶劑在低波長范圍內(nèi)有干擾作用，選擇280 nm為檢測(cè)波長。

2.2.2 方法學(xué)考察

圖2 泊那替尼紫外全波長掃描圖

線性關(guān)系考察:將2.2.1項(xiàng)下泊那替尼對(duì)照品溶液，用無水乙醇依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為 0.5，1.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0μg/mL的溶液。在280nm波長處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、溶液質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)作圖，回歸方程為A＝0.050 1C，r＝0.999 9（n＝6）。結(jié)果表明，泊那替尼的檢測(cè)質(zhì)量濃度在0.5～20μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密稱定適量泊那替尼對(duì)照品，配制成高、中、低（5，10，15 μg/mL）3 種不同質(zhì)量濃度的溶液，在 280 nm 波長處測(cè)定吸光度。分別在1d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，每次測(cè)定樣品3次，取吸光度平均值（A）計(jì)算日內(nèi)精密度，結(jié)果的 RSD分別為 0.80%，0.36% ，0.21% （n＝5）；連續(xù)測(cè)定 5 d，3 種溶液每天測(cè)定 1 次，每次測(cè)定樣品5次，取吸光度平均值（A）計(jì)算日間精密度，結(jié)果的 RSD 為 0.75% ，0.80% ，1.25% （n ＝ 5）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn):取泊那替尼原料藥適量，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下方法配制 5 μg/mL 的供試品溶液，分別加入 2.5，5.0，7.5μg/mL的對(duì)照品溶液，超聲混勻，作為 50% ，100%，150% 的加樣溶液。在280nm波長處測(cè)定吸光度，以5次測(cè)定的吸光度平均值（A）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1?？梢?，本試驗(yàn)中的紫外分光光度法可滿足藥物質(zhì)量分析的要求。

2.2.3 樣品含量測(cè)定

分別稱取同批次泊那替尼原料藥1mg，精密稱定，分別置3個(gè)10 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，超聲，定容，取適量，稀釋至10μg/mL，在280nm波長處測(cè)定吸光度（n＝3）。以 5次測(cè)定的吸光度平均值（A）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品含量。結(jié)果見表2。

3 討論

泊那替尼分子結(jié)構(gòu)中含有碳碳三鍵、苯環(huán)以及含N雜環(huán)等共軛結(jié)構(gòu)基團(tuán)，具有較強(qiáng)的紫外吸收，故可采用UV法與HPLC法分別測(cè)定泊那替尼原料藥含量。

HPLC法是一種常用的高效分離分析方法，能有效分離主藥成分與雜質(zhì)，排除雜質(zhì)干擾。本試驗(yàn)中優(yōu)選了流動(dòng)相種類以及比例，最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.2%三乙胺緩沖液（85∶15）。方法學(xué)考察結(jié)果表明，本試驗(yàn)確定的HPLC法快速、靈敏、準(zhǔn)確，精密度、加樣回收率和溶液短期穩(wěn)定性良好，適合于泊那替尼原料藥的質(zhì)量分析。

UV法具有使用方便、檢測(cè)快速和對(duì)儀器設(shè)備要求不高等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此是常用的檢測(cè)藥品含量的方法之一。本試驗(yàn)中的UV法，日內(nèi)精密度、日間精密度以及加樣回收率均符合相關(guān)檢測(cè)要求，說明UV法檢測(cè)泊那替尼原料藥方法可行。但UV法專屬性不高，主藥含量容易受到雜質(zhì)的干擾，因此測(cè)定結(jié)果和真實(shí)值可能存在一定的差異。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，與HPLC法相比，UV法誤差較大，和標(biāo)示量相比，UV法的誤差范圍是 HPLC法的1.432～6.102倍。因此，本試驗(yàn)確定的UV法只適用于泊那替尼含量的粗略測(cè)定，不適于泊那替尼原料藥含量的精密測(cè)定，而HPLC法才能更確切地反映其準(zhǔn)確含量，結(jié)果更具有真實(shí)性。

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