利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠腎臟病變的影響

李 里，盧 松

（重慶市中山醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400013）

糖尿病腎病（DN）是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，目前被認(rèn)為是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因[1]。利拉魯肽是一種胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物，2型糖尿病患者 GLP-1分泌功能受損，外源性給予利拉魯肽可明顯降低其血糖及體重，故該藥受到的關(guān)注越來越多。目前，關(guān)于利拉魯肽對(duì)糖尿病腎?。―N）的影響研究少見報(bào)道。本研究中，擬從白蛋白排泄率、生化、病理等方面觀察不同劑量利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠腎臟病變的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型的建立與分組

選擇雄性8周齡SD大鼠60只（購自重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心），體重（200 ±25）g，動(dòng)物合格證編號(hào)為 150449。2 型糖尿病模型制備，采用高糖高脂飲食1個(gè)月后一次性小劑量鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司）（30 mg/kg）腹腔內(nèi)注射[2]，STZ 用 0.1 mmol/L 無菌枸櫞酸緩沖液配制（pH＝4.5）。給藥72 h后連續(xù)3 d血糖不低于16.67mmol/L，尿糖定性（++）以上者視為造模成功。將 30只成模大鼠隨機(jī)平均分為3組，即糖尿病腎病組（DN組）、利拉魯肽100μg/kg組（L100 組）、利拉魯肽 200μg/kg組（L200組）。另取10只SD大鼠，腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液，作為正常對(duì)照組（NC組）。模型建立1周后，L100組、L200組分別給予利拉魯肽（諾和諾德中國公司）100μg/kg或 200μg/kg腹腔內(nèi)注射，每日2次，NC組與DN組給予等量生理鹽水注射。

1.2 標(biāo)本收集與測(cè)定

藥物干預(yù)12周后，以代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量并采用散射比濁法測(cè)定尿白蛋白排泄率（UAER）。24 h尿蛋白測(cè)定采用考馬斯亮蘭法，以牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝3.729 7 ×10-4X+0.397 7（r＝0.999 7），將每個(gè)標(biāo)本于 721 型分光光度計(jì)595 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度（A）值代入上述方程，所得值與尿量的乘積為24 h尿蛋白總量。稱體重（BW）后，腹主動(dòng)脈取血、離心，使用法國ABX型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。采血后分離左腎，去包膜，稱腎重（KW），計(jì)算腎臟肥大指數(shù) （KW/BW×103）。

1.3 腎臟病理檢查

取部分腎組織，經(jīng)4%戊二醛固定，常規(guī)脫水、滲透、包埋、切片等處理，透射電鏡觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu)變化。取部分腎組織，予4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、HE及PASM染色、透明、封片處理，光鏡觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)變化。在光鏡下（400倍）隨機(jī)取50個(gè)腎小球，用北航計(jì)算機(jī)醫(yī)學(xué)病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定腎小球平均截面積（MGA）、系膜平均面積（MMA），根據(jù)腎小球平均體積（MGV）＝1.25MGA 計(jì)算 MGV，系膜面積比（FMA）＝MMA/MGA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血糖、腎功能指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束，DM組死亡3只，L100組與L200組各死亡1只。與 DM 組比較，L100組與 L200組的 BUN，Scr，UAER，BG水平均明顯下降（P ＜0.05），L200組比 L100組下降更明顯（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血糖、腎功能指標(biāo)水平變化（±s）

表1 各組大鼠血糖、腎功能指標(biāo)水平變化（±s）

注:與 NC 組比較，P ＜0.05；與 DM 組比較，P ＜0.05；與 L100 組比較，P ＜0.05。下表同。

組別N C組（n＝1 0）D M 組（n＝1 2）L 1 0 0組（n＝1 4）L 2 0 0組（n＝1 4）B U N（m m o l/l）4.8 1±1.2 8 9.7 6±1.9 6 7.6 4±0.8 9 6.7 6±0.8 9 S c r（ m o l/L）5 3.8 6 ±5.1 2 9 3.8 6 ±1 1.3 1 7 8.2 8 ±1 0.1 2 6 8.7 6 ±7.4 3 U A E R（mg/2 4 h）2.7 8 ±0.1 0 7.8 7 ±0.5 7 5.4 4 ±0.3 7 4.1 4 ±0.2 8 B G（m m o l/L）5.4 9±0.6 9 1 8.3 8 ±4.0 1 9.6 4±3.8 9 8.1 5±2.1 1

2.2 腎臟肥大指標(biāo)

與 DM組比較，L100組與 L200組 KW，KW/BW，MGV，F(xiàn)MA增加的幅度明顯下降（P＜0.05），L200組比 L100組下降更明顯（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腎臟肥大指標(biāo)變化（±s）

表2 各組大鼠腎臟肥大指標(biāo)變化（±s）

組別N C組（n＝1 0）D M 組（n＝1 2）L 1 0 0組（n＝1 4）L 2 0 0組（n＝1 4）K W（g）1.7 8 ± 0.1 8 4.4 8 ± 0.3 7 3.6 5 ± 0.2 5 3.0 8 ±0.3 2 K W /B W（1 0-3）3.2 7 ± 0.2 6 5.8 7 ± 0.2 1 4.6 6 ± 0.4 4 4.1 5 ± 0.3 5 mg V（1 0 6 m 3）0.5 2 6 ± 0.0 2 0.8 5 6 ± 0.0 2 0.7 2 7 ± 0.0 5 0.6 8 6 ± 0.1 2 F M A 0.2 1 ± 0.0 1 0.5 8 ± 0.0 2 0.4 3 ± 0.0 6 0.3 6 ±0.0 6

2.3 腎組織病理學(xué)檢查

光鏡下，HE及PASM染色顯示，對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)規(guī)則、毛細(xì)血管基底膜（ECM）清晰可見，包曼氏囊清晰可見；DM組大鼠腎小球明顯肥大，部分腎小球呈分葉狀，系膜區(qū)增寬，基底膜增厚；L100組和L200組也出現(xiàn)上述改變，但程度明顯減輕，尤以L200組病變減輕明顯。見圖1及圖2。透射電鏡結(jié)果顯示NC組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)清晰，基底膜光滑、均質(zhì)，足突間隙明顯；DM組大鼠腎小球足細(xì)胞胞體腫脹，足突部分融合、脫落，系膜區(qū)基質(zhì)增多，基底膜增厚；L組上述改變減輕，尤以L200組病變減輕明顯。見圖3。

圖1 光鏡下大鼠腎臟HE染色圖像（400倍）

圖2 光鏡下大鼠腎臟PASM染色圖像（400倍）

圖3 大鼠腎臟透射電鏡圖像（10 000倍）

3 討論

糖尿病腎病特征性病理改變是系膜細(xì)胞肥大以及細(xì)胞外基質(zhì)成分堆積，腎小球基底膜增厚，最終導(dǎo)致腎小球硬化。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而高血糖是其發(fā)生發(fā)展的起始和核心因素。在腎臟中，長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可使腎小球上皮細(xì)胞分泌CD26增加[3]，導(dǎo)致腎臟局部血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等表達(dá)增加，刺激系膜外基質(zhì)沉淀，從而引起腎小球基底膜增厚，導(dǎo)致腎損害[4]。

利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1類似物，是治療糖尿病的新型藥物，通過抑制胰島β細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其增殖及前體細(xì)胞向β細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抑制肝糖輸出、促進(jìn)外周細(xì)組織對(duì)胰島素的敏感性，從而降低血糖。本研究結(jié)果顯示，與糖尿病組大鼠相比，不同劑量利拉魯肽治療組大鼠血糖均明顯降低，且腎功能各項(xiàng)指標(biāo)如尿素氮、肌酐好轉(zhuǎn)，24 h尿蛋白明顯下降，病理切片分析和電鏡檢查提示腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞增生、足細(xì)胞損傷等病理改變減輕，MGV及 FMA等病理指標(biāo)好轉(zhuǎn)，表明利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠腎臟有保護(hù)作用，能減輕腎小球高濾過和腎臟肥大，降低尿蛋白，改善腎功能，且200μg/kg劑量較100μg/kg的作用更顯著。但關(guān)于利拉魯肽的劑量與保護(hù)腎臟的療效是否成簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，以及達(dá)到腎臟保護(hù)作用的起始劑量，仍需要進(jìn)一步研究。

關(guān)于利拉魯肽減少蛋白尿、延緩腎功能惡化的機(jī)制，目前進(jìn)行的研究甚少。Chow等[5]通過db/db糖尿病小鼠研究了腎臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與腎損害的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腎臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與血糖、糖化血紅蛋白水平明顯相關(guān)，而與肥胖和血脂無關(guān)，腎臟巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活與蛋白尿和腎纖維化則是相關(guān)聯(lián)的。在STZ誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠DN模型中，腎臟巨噬細(xì)胞聚集同進(jìn)行性腎損傷和纖維化是有聯(lián)系的，糖尿病環(huán)境中的一些成分（如高血糖、糖化血紅蛋白等）可以刺激巨噬細(xì)胞經(jīng)由白細(xì)胞介素（IL-1）和血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）依賴途徑促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，從而可能增強(qiáng)腎纖維化[6]。因此推測(cè)，利拉魯肽可能通過降低血糖、糖化血紅蛋白水平，從而抑制巨噬細(xì)胞在腎臟局部的浸潤(rùn)，緩解蛋白尿和腎臟纖維化。

關(guān)于利拉魯肽腎臟保護(hù)作用的機(jī)制、劑量和時(shí)間依賴性，以及是否具有降糖作用之外的腎臟保護(hù)作用等問題，有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn):

[1]Zhou G，Li C，Cai L.Advanced glycation end-products induce connective tissue growth factor-mediated renal fibrosis predominantly through transforming growth factor beta-independent pathway[J].Am JPathol，2004，165:2 033-2 043.

[2]何清華，周迎生，王 征，等.2型糖尿病大鼠模型制備的影響因素及其特點(diǎn)[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007，15（6）:425-429.

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[4]Cha DR，Kang YS，Han SY，et al.Vascular endot helial growthfactor is increased during early stage of diabetic nephropathy in type-2 diabetic rats[J].JEndocrinol，2011，183:183-194.

[5]Chow F，Ozols E，Nikolic-Paterson DJ，et a1.Macrophages inmouse type 2 diabetic nephropathy:correlation with diabetic state and progressive renal injury[J].Kidney Int，2009，65（1）:116-128.

[6]Chow FY，Nikolic-Paterson DJ，Atkins RC，et al.Macrophages instreptozotocin-induced diabetic nephropathy:potential role in renal fibrosis[J].Nephrol Dial Transplant，2010，19（12）:2 987-2 996.