高效液相色譜法測定紫杉醇亞微乳含量

夏學軍，王艷寶，徐佳茗，張鵬霄，金篤嘉，劉玉玲

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所·藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點實驗室，北京 100050）

紫杉醇亞微乳是我所研制的不含Cremophor EL、載藥量高、可耐熱壓滅菌、長期貯存穩(wěn)定的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的水包油型亞微乳輸液[1]。動物試驗表明，與市售紫杉醇注射液相比，亞微乳可顯著降低過敏反應和毒性。在耐受劑量下，紫杉醇亞微乳比市售注射液對人乳腺癌MDA－MB－231裸鼠異種移植性腫瘤治療效果更好。目前，該藥已完成臨床前研究，正準備申報臨床。為了控制該藥的質(zhì)量，筆者參考2010年版《中國藥典（二部）》紫杉醇標準[2]，建立了紫杉醇亞微乳含量測定的高效液相色譜（HPLC）法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括G1322A型真空脫氣機、G1310A型四元泵、G1329A型自動進樣器、G1314B VWD型檢測器和 Chemstation型色譜工作站（Agilent公司）。紫杉醇對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為100382－200301）；三杉尖寧堿（紫杉醇雜質(zhì)Ⅰ，中國藥品生物制品檢定所，批號為100926－200701）；7－表－10－去乙?；仙即迹ㄗ仙即茧s質(zhì)Ⅱ，中國藥品生物制品檢定所，批號為100925－200701）；紫杉醇亞微乳（批號為 20110409－1，20110409－2，20110415，規(guī)格為 1.176 g/L）；空白亞微乳（輔料，按紫杉醇亞微乳的處方和工藝不加主藥制備而得，批號為 20100716）；無水乙醇（色譜純，J.T.Baker公司）；乙腈（色譜純，J＆K Chemical Ltd.）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Zorbax XDB C18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）；流動相：甲醇－水－乙腈（23 ∶41 ∶36）；流速：1.5 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：40℃；檢測波長：227 nm。分別取紫杉醇、三杉尖寧堿、7－表－10－去乙?；仙即紝φ掌愤m量，用無水乙醇溶解制成一定濃度的溶液，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，進行色譜峰定位。另取紫杉醇、三杉尖寧堿、7－表－10－去乙?；仙即紝φ掌愤m量，用無水乙醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為 0.5，2.5，2.5 μg/mL 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液，取 10 μL 注入高效液相色譜儀測定。結(jié)果三杉尖寧堿及7－表－10－去乙?；仙即寂c紫杉醇的相對保留時間分別為 0.89，1.09 min，分離度分別為 2.40，1.67，色譜圖見圖 1。

2.2 溶液制備

取紫杉醇適量，精密稱定，加無水乙醇溶解制成質(zhì)量濃度為1.2 g/L 的貯備溶液。分別精密量取 0.8，1.0，1.2 mL（相當于供試品溶液測定濃度的80%，100%，120%）各3份，置25 mL容量瓶中，分別加入空白亞微乳（輔料）0.8，1.0，1.2 mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成相當于紫杉醇含量80%，100%，120%的溶液，即得空白對照溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取空白亞微乳（輔料）1 mL，置25 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為輔料溶液，取10 μL注入高效液相色譜儀。結(jié)果表明，輔料對亞微乳的含量測定無干擾。色譜圖見圖 1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：取紫杉醇適量，精密稱定，加無水乙醇溶解制成質(zhì)量濃度為 1.2 g/L 的溶液。分別精密量取 0.2，0.5，1，1.5，2 mL，置25 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為 9.6，24，48，72，96 μg/mL 的標準溶液。分別取 10 μL 注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣3次。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、平均峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝13.788 7 X－3.424 4， r＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果的 RSD 分別為0.12% ，0.12% ，0.10% ，0.16% ，0.08% ，表明紫杉醇樣品質(zhì)量濃度在9.6～96 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系。

定量限檢測：紫杉醇質(zhì)量濃度為 0.3 μg/mL，進樣量為 10 μL，其峰信號約為噪音的10倍，計算得該方法的定量限為3 ng。

重復性試驗：取同一紫杉醇亞微乳樣品6份，按擬訂方法測定紫杉醇含量。結(jié)果，樣品含量測定的 RSD為0.31%（n＝6），表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液 10 μL，分別于 0，2，4，6，8，10，12 h時進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.16%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。取紫杉醇適量，精密稱定，加無水乙醇溶解制成質(zhì)量濃度為 1.2 g/L 的貯備溶液。分別精密量取 0.8，1.0，1.2 mL(相當于供試品溶液測定濃度的80%，100%，120%)各3份，置25 mL 容量瓶中，分別加入空白亞微乳(輔料)0.8，1.0，1.2 mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成相當于紫杉醇含量80%，100%，120%的溶液，即得空白對照溶液。按擬訂方法測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率測定結(jié)果（n＝9）

2.4 樣品含量測定

精密量取本品1 mL，置25 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另取紫杉醇對照品約22mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，振搖使溶解，精密量取1 mL，置50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。按擬訂色譜條件，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，采用外標法計算含量。結(jié)果，批號為20110409－1，20110409－2，20110415的樣品中，紫杉醇的含量分別為標示量的 95.2% ，96.1% ，97.8% 。

3 討論

2010年版《中國藥典（二部）》收載了紫杉醇藥品標準，其含量測定項下的系統(tǒng)適用性試驗中，規(guī)定了紫杉醇峰與三杉尖寧堿（雜質(zhì)Ⅰ）峰及7－表－10－去乙?；仙即迹s質(zhì)Ⅱ）的分離度均應大于1.0。在流動相篩選時，在現(xiàn)有色譜條件下，對目前紫杉醇含量測定通常采用的3種流動相系統(tǒng)（甲醇－水、乙腈－水、甲醇－乙腈－水）進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇－水、乙腈－水系統(tǒng)為流動相時，調(diào)整流動相比例使紫杉醇的保留時間在12 min范圍內(nèi)，方法的系統(tǒng)適用性均不能滿足中國藥典要求。

在紫杉醇亞微乳研究中，我們采用建立的HPLC有關物質(zhì)檢查法進行紫杉醇亞微乳及空白亞微乳（輔料）的強制降解試驗、影響因素試驗、加速試驗及長期試驗時發(fā)現(xiàn)，輔料對紫杉醇測定無干擾，亞微乳降解后主要產(chǎn)生2個雜質(zhì)，經(jīng)與美國藥典收載的紫杉醇標準中各個雜質(zhì)峰的相對保留時間進行比較，并與雜質(zhì)對照品的保留時間進行比對，鑒定降解產(chǎn)物為10－去乙?；仙即技?－表－紫杉醇。故在擬訂色譜條件下，試驗了10－去乙?；仙即技?－表－紫杉醇對紫杉醇含量測定的干擾，結(jié)果10－去乙酰基紫杉醇及7－表－紫杉醇與紫杉醇的相對保留時間分別為 0.64，1.71 min，降解產(chǎn)物不干擾主成分測定。因此，按照 2010年版《中國藥典（二部）》紫杉醇標準含量測定項下規(guī)定的系統(tǒng)適用性試驗，即可保證本品測定方法的專屬性符合要求。

亞微乳是由油、水、表面活性劑組成。由于藥物與油脂分離困難，目前亞微乳含量測定供試品溶液制備時，除少量文獻采用以高溫、堿、鹽等破乳后再用有機溶劑提取藥物的方法外，大多采用直接用有機溶劑溶解稀釋的方法。由于紫杉醇對高溫、堿不穩(wěn)定，我們前期曾參考文獻[3]，對鹽破乳后再用有機溶劑提取的方法進行了研究，但未能同時獲得紫杉醇與油脂的完全分離及合格的回收率。因此，本方法采用有機溶劑溶解稀釋的方式制備供試品溶液。對有機溶劑進行的篩選表明，在測定濃度下，甲醇、乙腈均不能溶解紫杉醇亞微乳，無法滿足紫杉醇測定濃度的要求，故選擇無水乙醇作為本品的測定溶劑。

參考文獻：

[1] Xia XJ，Guo RF，Liu YL，et al.Formulation，characterization and hypersensitivity evaluation of anintravenous emulsion loaded with a paclitaxel－cholesterol complex[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2011，59（3）:321－326.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1 007－1 008.

[3] 李 萌，王杏林，葛志強，等.HPLC法測定依托泊苷亞微乳中的藥物含量[J].中國新藥雜志，2007，16（17）：1 390－1 392.