不同來源莪術(shù)中姜黃素類成分的含量差異研究

蔡穎，宋珅，徐杰，陳建偉，崔小兵

1南京市白下區(qū)建中中醫(yī)院，南京 210004；2南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023；3溫州市天禾生物科技有限公司，浙江溫州 325608

不同來源莪術(shù)中姜黃素類成分的含量差異研究

蔡穎1，宋珅2*，徐杰3，陳建偉2，崔小兵2

1南京市白下區(qū)建中中醫(yī)院，南京 210004；2南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023；3溫州市天禾生物科技有限公司，浙江溫州 325608

目的：用高效液相色譜法測定不同來源的莪術(shù)中3種姜黃素成分，比較姜黃素（curcumin，Ⅰ）、去甲氧基姜黃素（demethoxycurcumin，Ⅱ）和雙去甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin，Ⅲ）的含量差異。方法：采用Kromasil色譜柱,流動相為乙腈-水（0.5%冰乙酸）,流速為1 mL· min-1，檢測波長為425 nm。結(jié)果：姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的線性范圍分別為0.04～0.16 μg（r=0.9991）、0.037～0.150 μg（r=0.9990）、0.00015～0.00062 μg（r=0.9996）；平均回收率（n=9）分別為103.32%、100.32%、100.06%。結(jié)論：不同來源的莪術(shù)中姜黃素類成分的含量存在著明顯的差異。

姜黃素；去甲氧基姜黃素；雙去甲氧基姜黃素；莪術(shù)；高效液相色譜法

莪術(shù)是姜科姜黃屬植物的根莖，是一種常用的傳統(tǒng)中藥?！吨袊幍洹?010年版一部莪術(shù)項下[1]共收載了3種植物來源,即蓬莪術(shù)（Curcuma phaeocaulisValeton）、廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensisS. G.Lee et C.F.Liang）和溫莪術(shù)（溫郁金，Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling），原植物標(biāo)本見圖1。莪術(shù)中含有兩大類成分，即揮發(fā)油（1%～2.5%）和姜黃素類成分[2]（結(jié)構(gòu)式見圖2）。其中，姜黃素具有抗腫瘤、護(hù)肝、調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎和降血脂等多重藥理作用，臨床上可應(yīng)用于腫瘤、腦梗死和高血脂等多種疾病的治療，對肝炎和眼科系統(tǒng)也有一定療效[3]。現(xiàn)在分析姜黃素類化合物方法有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]、分光光度法[5]、RP-HPLC法[6]。由于高效液相色譜法具有分析速度快、分離效率高、靈敏度高、檢測自動化、適用范圍廣、組分易回收、樣品處理簡單等優(yōu)點，因此，本文使用HPLC法對莪術(shù)中的姜黃素類成分進(jìn)行了研究。對3種不同來源、14個不同產(chǎn)地的莪術(shù)藥材中姜黃素類成分：姜黃素（curcuminⅠ）、去甲氧基姜黃素（demethoxycurcuminⅡ）和雙去甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcuminⅢ）進(jìn)行了含量測定，為制定莪術(shù)飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及臨床評價莪術(shù)質(zhì)量提供參考。

圖1 3種莪術(shù)原植物標(biāo)本

圖2 3種姜黃素成分化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 實驗材料

1.1 儀器

Waters 2690高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

1.2 藥品與試劑

姜黃素對照品（批號：110823-201004，中國藥品生物制品檢定所）；去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素對照品（純度＞99．0%，上海源葉生物技術(shù)有限公司）。

甲醇（色譜純）；乙醇（分析純）；超純水系統(tǒng)（美國Merck Millipore公司）。

藥材：溫莪術(shù)又稱溫郁金Curcuma wenyujin，從浙江省溫州市12個不同地區(qū)收集的藥材；蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis5個批次購自成都荷花池藥材市場（四川產(chǎn)）；廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis2個批次購自廣西省玉林市。經(jīng)本文作者之一陳建偉鑒定均符合《中國藥典》規(guī)定的藥材。

2 實驗方法

2.1 樣品的揮發(fā)油含量測定

準(zhǔn)確稱取各產(chǎn)地鮮品溫莪術(shù)、加工品溫莪術(shù)放入1000 mL圓底燒瓶中，加入水，參照2010年版《中國藥典》一部（附錄ⅩD）揮發(fā)油測定甲法進(jìn)行總揮發(fā)油提取，無水硫酸鈉脫水干燥，得揮發(fā)油，計算揮發(fā)油得率，結(jié)果見表1。

表1 藥材揮發(fā)油及浸出物測定結(jié)果

2.2 浸出物測定

照《中華人民共和國藥典》附錄ⅩA項下的熱浸法測定，用稀乙醇做溶劑，結(jié)果見表1。

2.2.1 色譜條件的選擇色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為0.5%冰醋酸水溶液，B相為甲醇，梯度洗脫（0 min：56%A，44%B；9 min：48%A，52%B；15 min：38%A，62%B）；檢測波長：425 nm；柱溫：35℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素峰計算均不少于3000。HPLC圖譜見圖3。

圖3 對照品（A）和樣品（B）的HPLC圖

2.2.2 供試品溶液提取制備條件的考察為確定供試品溶液最佳提取制備條件，對提取溶媒、提取方式及提取時間進(jìn)行考察。

取溫莪術(shù)粉末約0.5 g 3份，精密稱定，分別加入溶媒（75%乙醇、無水乙醇、甲醇）10 mL，超聲提取器提取，揮干溶劑，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定，計算含量。結(jié)果表明，采用75%乙醇超聲提取效果較好，且色譜峰峰形較好；而采用無水乙醇或甲醇提取的樣品，三種姜黃素的提取效率均較75%乙醇提取的樣品低，故確定采用75%乙醇超聲提取。取干燥至恒重的上述溫莪術(shù)粉末0.5 g，3份，精密稱定。（1）置于250 mL圓底燒瓶，加75%乙醇150 mL，加熱回流2 h；（2）置于100 mL具塞三角瓶中，加入75%乙醇100 mL，密塞，一次冷浸12 h；（3）置于100 mL具塞三角瓶中，加75%乙醇30 mL，超聲提取30 min。3種提取液分別過濾、濃縮，最后用甲醇定容至1 mL量瓶中。進(jìn)樣10 μL，記錄HPLC色譜圖，結(jié)果表明，（2）和（3）測定結(jié)果基本一致，而（1）提取效果較差。故選用超聲提取法。為保證超聲提取的效率，提取用的溶媒體積為30 mL，樣品提取至無色后對成分含量的影響較小，提取次數(shù)為2次。歸納表明，樣品使用75%乙醇作溶劑；以超聲提取2次，每次75%乙醇用量為30 mL，時間為20 min為宜。

確定供試品溶液的最佳提取條件為：藥材過60目篩，精密稱定藥材粉末0.5 g，置50 mL離心管中,每次加入75%乙醇30 mL，超聲振蕩20 min，共計2次，提取液離心（轉(zhuǎn)速4920 r·min-1，15 min）、過濾，用少量75%乙醇洗滌殘渣及濾器，合并濾液，揮干溶劑，殘渣加甲醇溶解并定容至1 mL量瓶，過微孔濾膜（0.45 μm），作為供試品。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍考察對照品溶液的制備：精密稱取各對照品適量，加入甲醇制成每1 mL分別含雙去甲氧基姜黃素0.00007745 mg、去甲氧基姜黃素0.0187 mg、姜黃素0.0408 mg的溶液，作為對照品儲備液。分別精密吸取上述對照品溶液，用甲醇配制成混合對照品溶液。其中，雙去甲氧基姜黃素濃度為0.01548、0.03098、0.03872、0.04646、0.06196 μg·mL-1，去甲氧基姜黃素濃度為3.74、7.48、9.35、11.22、14.96 μg·mL-1，姜黃素濃度為8.16、10.20、12.24、16.32、32.64 μg·mL-1；分別吸取不同濃度對照品溶液10 μL進(jìn)行分析測定。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的回歸方程和相關(guān)系數(shù)及線性范圍分別為：Y= 26044X-3073.8，r2=0.9992，0.01548～0.06196 μg·mL-1；Y=153619X-286066，r2=0.9981，3.728～14.96 μg· mL-1；Y=128598X-222001，r2=0.9982，8.16～32.64 μg·mL-1。

2.3.2 精密度試驗精密吸取雙去甲氧基姜黃素0.06196 μg·mL-1、去甲氧基姜黃素14.96 μg·mL-1、姜黃素16.32 μg·mL-1的混合對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的RSD分別為0.5%、0.2%、0.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗取同一產(chǎn)地溫莪術(shù)藥材（產(chǎn)地雁湖鄉(xiāng)），粉碎過60目篩，精密稱量0.5 g，共5份，按確定的供試品溶液制備條件制備并按上述色譜條件測定，結(jié)果雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的含量的RSD分別為0.4%、0.64%、0.43%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗取重現(xiàn)性試驗的1號樣品依次于不同時間段進(jìn)樣測定峰面積值，雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的峰面積的RSD分別為0.41%、0.24%、0.58%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗分別精密稱取已知含量的溫莪術(shù)干燥藥材（產(chǎn)地：雁湖鄉(xiāng)），粉碎，過60目篩，取約0.25 g，共6份，精密稱定，置50 mL離心管中，分別加入等同于樣品中的雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含量80%、100%、120%的對照品，每次加入75%乙醇30 mL，超聲提取20 min，共2次，提取液離心（轉(zhuǎn)速4920 r·min-1，15 min），過濾，濃縮定容至1 mL量瓶，作為供試品。過微孔濾膜（0.45 μm），取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，測定含量，結(jié)果見表2。

表2 雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素加樣回收率試驗結(jié)果

結(jié)果表明，雙去甲氧基姜黃素的平均回收率為100.74%，RSD為2.33%；去甲氧基姜黃素的平均回收率為101.03%，RSD為2.80%；姜黃素的平均回收率為100.40%，RSD為2.02%。樣品的加樣回收率試驗結(jié)果符合含量測定方法學(xué)的要求。

2.3.6 姜黃素類成分的含量測定取14個不同產(chǎn)地的莪術(shù)藥材，每個產(chǎn)地平行3份，按照“2.2.2”項下制備成待測溶液（由于產(chǎn)自四川省雙流鎮(zhèn)的蓬莪術(shù)1號及2號樣品中姜黃素的含量較高，在檢測前將樣品稀釋了1倍），精密吸取10μL注入色譜儀，記錄色譜圖。外標(biāo)法計算供試品溶液中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的含量。結(jié)果見表3。

3 討論與小結(jié)

3.1 從檢測結(jié)果可知：溫莪術(shù)中雙去甲氧基姜黃素的平均含量在0.063 μg·g-1～0.113 μg·g-1，去甲氧基姜黃素的平均含量在6.035 μg·g-1～14.097 μg·g-1，姜黃素的平均含量在12.838 μg·g-1～31.423 μg·g-1。蓬莪術(shù)中雙去甲氧基姜黃素的平均含量在0.270 μg·g-1～1.365 μg·g-1，去甲氧基姜黃素的平均含量在10．707 μg·g-1～16．923 μg·g-1，姜黃素的平均含量在22．722 μg·g-1～37．449 μg·g-1。而廣西莪術(shù)中的所有姜黃素類成分均未檢出。

表3 不同來源的莪術(shù)藥材中姜黃素類成分的含量測定結(jié)果（n=3）

3.2 本文同時進(jìn)行了揮發(fā)油及醇浸出物含量的測定，與姜黃素類成分含量測定結(jié)果相對照發(fā)現(xiàn)：3個品種的莪術(shù)在姜黃素類成分含量及揮發(fā)油含量上相差較大：川產(chǎn)蓬莪術(shù)姜黃素類成分含量較高，浙江省產(chǎn)的溫莪術(shù)揮發(fā)油含量較高。這可能是由于產(chǎn)地及品種不同所致。試驗中曾測定2批廣西莪術(shù)，發(fā)現(xiàn)均不含姜黃素類成分，且藥材的其它成分含量也較為低下。本次實驗中未檢測出廣西莪術(shù)的姜黃素類成分的原因有可能是這一藥材品種本身姜黃素類成分含量很低，藥材的質(zhì)量不佳，也有可能是藥材在采收加工中使用的方法不當(dāng)導(dǎo)致的。因此，在藥材采收及加工過程中，選擇合理的采收時間及使用規(guī)范的加工方法對保證藥材的質(zhì)量相當(dāng)重要。提示有必要對3種不同品種的莪術(shù)藥材在采收及加工過程中的變化進(jìn)行研究，并對這3個不同品種的莪術(shù)藥材中姜黃素類成分、揮發(fā)油進(jìn)行分別規(guī)定。同時檢測結(jié)果也表明，同一品種如溫莪術(shù)中姜黃素類成分含量與揮發(fā)油含量之間沒有相關(guān)性。

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Research on Contents of Curcuminoids in Different Curcuma Samples

CAI Ying1,SONG Shen2*,XU Jie3,CHEN Jian-wei2,CUI Xiao-bing21Baixia District Jianzhong Hospital of Nanjing,Nanjing 210004,China;2Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;3Wenzhou TianHe Biological Technology Co.LTD,Wenzhou 325608,China

Objective：To research on the content differences of curcuminoids including curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin in Rhizoma Curcumae from different sources．Methods：A reversed-phase HPLC system consisting of an ODS column and a mixture of acetonitrle-water(with 0．5% acetic acid)as the mobile phase was used．The flow rate was 1．0 mL·min-1and the detection was effected at 425 nm．Results：The calibration curves of curcumin,demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin were linear in the range of 0．04～0．16 μg(r=0．9991),0．037～0．150 μg(r=0．9990),0．00015～0．00062 μg(r= 0．9996),respectively;The average recoveries(n=9)were 103．32%,100．32%and 100．06%,respectively．Conclusion：The results showed that the contents of curcuminoids vary with sample source．

Curcumin;Demethoxycurcumin;Bisdemethoxycurcumin;Curcuma wenyujin;HPLC

R927.2

A

1673-7806（2014）06-502-04

蔡穎，女，副主任藥師 E-mail:njcyworld@sina.com

*通訊作者 宋珅，男，副教授 E-mail:songseng@yeah.net

2014-05-30

2014-07-09