復(fù)制蛋白A與肝癌DNA損傷修復(fù)的研究進(jìn)展

復(fù)制蛋白A是目前國(guó)內(nèi)外研究細(xì)胞 DNA損傷修復(fù)的熱點(diǎn)之一。RPA 是真核細(xì)胞中主要的單鏈結(jié)合蛋白，包含RPA1，RPA2和RPA3三個(gè)亞單位。RPA在 DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中起著重要的作用。DNA復(fù)制時(shí)，RPA具有解鏈、結(jié)合單鏈模板并維持 DNA 連續(xù)復(fù)制的功能；DNA 損傷時(shí)，RPA與具有染色體結(jié)構(gòu)維持、保護(hù)、修復(fù)功能的蛋白質(zhì)聚集在DNA損傷位點(diǎn)，共同完成對(duì) DNA 損傷的檢測(cè)并進(jìn)行修復(fù)。因此RPA對(duì)于細(xì)胞調(diào)控DNA修復(fù)過(guò)程至關(guān)重要。目前肝癌的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，但其發(fā)生與DNA的損傷積累密切相關(guān)。誘發(fā)肝癌的主要危險(xiǎn)因素包括乙型肝炎病毒，黃曲霉毒素B1，亞硝胺等，這些誘因不僅能夠引起肝細(xì)胞DNA的損傷，而且能直接或間接影響損傷修復(fù)系統(tǒng)，使DNA修復(fù)障礙，從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。本文就RPA在DNA損傷修復(fù)中起到的重要作用及其肝癌DNA損傷修復(fù)的關(guān)系作一綜述。

1復(fù)制蛋白A的結(jié)構(gòu)

復(fù)制蛋白A（replication protein A，RPA）是真核細(xì)胞單鏈DNA（single stranded DNA，ssDNA）結(jié)合蛋白，ssDNA是細(xì)胞中普遍存在且相對(duì)重要的物質(zhì)，在ssDNA形成過(guò)程中RPA發(fā)揮重要作用。RPA共由70，34和14-kDa 3個(gè)亞單位組成，通常各自稱為RPA1，RPA2，RPA3。每個(gè)亞單位都含有至少一個(gè)DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）。RPA1含有4個(gè)DBD結(jié)構(gòu)域，分別稱為，DBDA，DBDB，DBDC和DBDF。其中DBDA，DBDB的DNA結(jié)合活性最強(qiáng)，DBDC與其他兩個(gè)亞單位形成復(fù)合物過(guò)程中起著非常重要的作用。兩個(gè)較小的亞單位RPA2和RPA3分別含有DBDD和DBDE，有較弱的DNA 結(jié)合活性。RPA1，RPA2含有磷酸化位點(diǎn)，正常細(xì)胞周期中可被細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin and cycle dependent kinase，cyclin-CDK）磷酸化[1]。

2復(fù)制蛋白 A與DNA損傷及修復(fù)

DNA是機(jī)體生命活動(dòng)中最重要的遺傳物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性的保持對(duì)于細(xì)胞的正常生理活動(dòng)具有重要意義。但是DNA面臨來(lái)自于生物體內(nèi)部和外部的侵襲，內(nèi)外各種因素的作用下可不斷出現(xiàn)DNA損傷。盡管如此，細(xì)胞仍能保持正常的生長(zhǎng)、分裂和繁殖，說(shuō)明基因組處于有效的監(jiān)控之下。生物體基因組完整性和穩(wěn)定性的維持依賴于體內(nèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)。細(xì)胞通過(guò)周期阻滯修復(fù)DNA或者細(xì)胞凋亡對(duì)DNA損傷產(chǎn)生反應(yīng)。而如果細(xì)胞對(duì)DNA損傷異常反應(yīng)將導(dǎo)致疾病的發(fā)生，例如腫瘤。

2.1 DNA損傷修復(fù)DNA損傷修復(fù)是保持細(xì)胞基因組完整性的重要機(jī)制。DNA損傷修復(fù)是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程。針對(duì)不同形式的損傷其修復(fù)方式也大不相同，DNA修復(fù)方式主要有以下幾種：堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER），主要負(fù)責(zé)切除或替換由內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)引起的堿基修飾或單鏈斷裂；核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER），針對(duì)DNA鏈螺旋扭曲損傷、鏈內(nèi)交聯(lián)及某些形式的氧化損傷；錯(cuò)配修復(fù)（DNA mismatch repair，MMR），主要針對(duì)一些由DNA損傷試劑引起堿基錯(cuò)配以及在DNA復(fù)制和重組過(guò)程中單個(gè)堿基的錯(cuò)配和小的插入或缺失；雙鏈斷裂修復(fù)（double strand break，DSB repair），主要針對(duì)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)。

2.2復(fù)制蛋白 A和核苷酸切除修復(fù)當(dāng)DNA出現(xiàn)損傷時(shí)，RPA參與DNA損傷識(shí)別，RPA與著色性干皮病A蛋白（Xeroderma Pigmentosum GroupA，XPA）形成RPA-XPA復(fù)合物，此復(fù)合物與受損DNA的結(jié)合能力要強(qiáng)于RPA或者XPA，且此復(fù)合物與受損的DNA的結(jié)合能力要強(qiáng)于未受損的DNA[2]。他們招募通用轉(zhuǎn)錄因子 （transcription repair factor IIH，TFIIH）到達(dá)損傷部位。然后TFIIH的兩個(gè)亞基XPB和XPD打開(kāi)損傷的DNA，然后由DNA切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因和DNA修復(fù)基因F異二聚體（ERCCI/XPF）切除損傷DNA的5'端，DNA修復(fù)基因XPG切除3'端，去除包含損傷部位的寡核苷酸片段，隨后由DNA聚合酶填充于該間隙，合成新的DNA，最后由DNA連接酶補(bǔ)平缺口[3]。

2.3復(fù)制蛋白 A和堿基切除修復(fù)RPA在堿基切除途徑中的作用尚不明確，已經(jīng)證實(shí)的是RPA在堿基切除修復(fù)途徑中與細(xì)胞核內(nèi)尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG2） 和 DNA修復(fù)酶hMYH相互作用，從而定位受損的DNA位置。在堿基切除修復(fù)的最后階段，RPA起到激活DNA連接酶Ⅰ的作用[4]。

2.4復(fù)制蛋白A和DNA錯(cuò)配修復(fù)Lin YL等[5]研究顯示，RPA1結(jié)構(gòu)上的點(diǎn)突變形成的突變型RPA并不支持MMR，但卻支持NER，此研究表明RPA有多種途徑與相關(guān)蛋白相互作用從而對(duì)DNA修復(fù)產(chǎn)生影響。在MMR中，RPA可以結(jié)合ssDNA防止核酸酶的降解。當(dāng)堿基錯(cuò)配發(fā)生時(shí)，RPA還可以激活Exo1途徑進(jìn)行DNA修復(fù)，當(dāng)修復(fù)完成后，RPA隨即終止此途徑[6]。Guo等[7]證實(shí)，在MMR途徑中RPA與ssDNA結(jié)合后，磷酸化后的RPA2與RPA1的 DBD F結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而降低與ssDNA結(jié)合能力。

2.5復(fù)制蛋白 A與DNA雙鏈斷裂修復(fù)當(dāng)DNA雙鏈斷裂時(shí)，首先是 MRN 復(fù)合物（Mrell-Rad50-Nbsll）切割雙鏈斷裂的 DNA （DNA double-strand breaks， DSBs）末端產(chǎn)生 3′ 突出。RPA與ssDNA形成的復(fù)合物會(huì)聚集在斷裂部位的3′端，保護(hù)DNA阻止二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，隨后RPA通過(guò)與Rad52蛋白相互作用形成RPA-Rad52復(fù)合物，RPA-Rad52復(fù)合物提高了結(jié)合ssDNA的能力。此復(fù)合物在Rad52上形成含有Arg-Gln-Lys序列的結(jié)構(gòu)域，隨后Rad52與RPA2的C端相互作用，在Rad52上形成酸性結(jié)構(gòu)域，此酸性結(jié)構(gòu)域?qū)NA修復(fù)至關(guān)重要，并且Rad52上的酸性結(jié)構(gòu)域可以調(diào)節(jié)此復(fù)合物與ssDNA的結(jié)合能力[8]。在Rad52的調(diào)控下RPA從ssDNA上脫離，然后Rad51結(jié)合在ssDNA的3′端，促進(jìn)同源 DNA間進(jìn)行鏈交換，修復(fù)可能的缺失并連接DNA 鏈的斷裂，隨后RPA磷酸化。磷酸化的RPA更頻繁的與Rad51 和Rad52相互作用，結(jié)果是降低與RPA與ssDNA的結(jié)合能力。

3肝癌與 DNA 損傷

人體細(xì)胞經(jīng)常受到多種體內(nèi)外因子的影響，這些因素中會(huì)造成各種各樣的 DNA損傷，如果損傷被正確修復(fù)，細(xì)胞存活，如果修復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)缺失插入等不正確的修復(fù)，這些異常堿基的累積就可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。目前肝癌的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，但其發(fā)生與DNA的損傷積累密切相關(guān)。誘發(fā)肝癌的主要危險(xiǎn)因素包括乙丙型肝炎病毒，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1），亞硝胺，氧化應(yīng)激等，這些誘因不僅能夠引起肝細(xì)胞DNA的損傷，而且能直接或間接影響損傷修復(fù)系統(tǒng)，使DNA修復(fù)障礙，從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。其中HBV表達(dá)的HBx是一個(gè)多功能蛋白，它具有調(diào)控細(xì)胞凋亡，基因穩(wěn)定性等作用，它是 HCC 發(fā)生的一個(gè)重要影響因子。它能與TFIIH結(jié)合，抑制DNA修復(fù)并且引起DNA損傷以及損傷積累，最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。氧化應(yīng)激則是導(dǎo)致體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基產(chǎn)生過(guò)多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。AFB1的作用機(jī)制主要是誘導(dǎo)AFB1-DNA結(jié)合物的形成并且引起DNA鏈斷裂，DNA堿基突變以及氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[9]。因此，對(duì)于致癌因素的發(fā)生機(jī)制已經(jīng)有所了解，但是還未完全闡明，在以后的研究中還需著手于信號(hào)通路的研究，從其發(fā)生本質(zhì)上研究，為以后肝癌的治愈提供理論基礎(chǔ)。

4RPA的臨床研究

腫瘤患者體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體。J.E.Tomkiel等[10]采用ELISA方法檢測(cè)乳腺癌患者及對(duì)照正常人血清中的RPA2的自身抗體，結(jié)果顯示801例乳腺癌患者中有87例表達(dá)顯著升高，39例原位癌患者中有4例RPA表達(dá)明顯升高，65例正常人中無(wú)1例RPA2表達(dá)異常。因此他們認(rèn)為RPA2在乳腺癌中是一種自身抗原，可以作為腫瘤診斷指標(biāo)。但RPA2的表達(dá)水平與患者的預(yù)后，腫瘤轉(zhuǎn)移臨床特征等沒(méi)有相關(guān)性。同時(shí)他們又用同樣的方法檢測(cè)了22例肺癌患者和35例頭頸部腫瘤患者的RPA2抗體表達(dá)情況，結(jié)果有1例肺癌患者及2例頭頸部腫瘤患者RPA2抗體表達(dá)異常升高。Nikolaos Givalos等[11]運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)RPA1、RPA2在130例結(jié)腸癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示RPA1、RPA2在癌組織中高表達(dá)，且與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)。他們推測(cè)RPA在臨床分期高的組織中表達(dá)越高的原因是RPA參與DNA的修復(fù)，臨床分期越高的腫瘤組織中DNA損傷越多，故RPA反饋性的表達(dá)升高。RPA在結(jié)腸癌組織中的高表達(dá)可能不是RPA基因突變的結(jié)果，Popandaet等[12]發(fā)現(xiàn)RPA蛋白在結(jié)腸癌組織中的氨基酸序列沒(méi)有改變。Levidou G等[13]報(bào)道RPA1和RPA2在膀胱癌中同樣過(guò)度表達(dá)。有趣的是，隨著腫瘤的臨床分期的升高，RPA的表達(dá)越少。他們推測(cè)RPA在腫瘤形成的早期有著重要作用，隨著腫瘤的進(jìn)展RPA的作用逐漸減弱，這與先前RPA在其他腫瘤中的表達(dá)情況相反。國(guó)內(nèi)于大海等[14]檢測(cè)RPA1和RPA2在食管癌中的表達(dá)情況，RPA1和RPA2在食管癌組織中高表達(dá)，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分級(jí)等病理特征具有相關(guān)性，得出RPA有望成為預(yù)測(cè)食管癌患者預(yù)后的指標(biāo)。這些有關(guān)RPA的臨床研究表明，RPA有可能成為預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Nuss JE， Patrick SM， Oakley GG， et al. DNA damage induced hyperphosphorylation of replication protein A. 1. Identification of novel sites of phosphorylation in response to DNA damage[J]. Biochemistry， 2005， 44(23):8428-8437.

[2]Patrick SM， Turchi JJ. Xeroderma pigmentosum complementation group A protein (XPA) modulates RPA-DNA interactions via enhanced complex stability and inhibition of strand separation activity[J]. J Biol Chem， 2002， 277(18):16096-16101.

[3]Overmeer RM， Moser J， Volker M， et al. Replication protein A safeguards genome integrity by controlling NER incision events[J]. J Cell Biol， 2011， 192(3):401-415.

[4]Ranalli TA， DeMott MS， Bambara RA. Mechanism underlying replication protein a stimulation of DNA ligase I[J]. J Biol Chem， 2002， 277(3):1719-1727.

[5]Lin YL， Shivji MK， Chen C， et al. The evolutionarily conserved zinc finger motif in the largest subunit of human replication protein A is required for DNA replication and mismatch repair but not for nucleotide excision repair[J]. J Biol Chem， 1998， 273(3):1453-1461.

[6]Genschel J， Modrich P. Functions of MutLalpha， replication protein A (RPA)， and HMGB1 in 5'-directed mismatch repair[J]. J Biol Chem， 2009， 284(32):21536-21544.

[7]Guo S， Zhang Y， Yuan F， et al. Regulation of replication protein A functions in DNA mismatch repair by phosphorylation[J]. J Biol Chem， 2006， 281(31):21607-21616.

[8]Jiang G， Zou Y， Wu X. Replication-mediated disassociation of replication protein A-XPA complex upon DNA damage: implications for RPA handing off[J]. Cell Biol Int， 2012， 36(8):713-720.

[9]Long XD， Ma Y， Zhou YF， et al. XPD codon 312 and 751 polymorphisms， and AFB1 exposure， and hepatocellular carcinoma risk[J]. BMC Cancer， 2009， 9:400.

[10]Tomkiel JE， Alansari H， Tang N， et al. Autoimmunity to the M(r) 32，000 subunit of replication protein A in breast cancer[J]. Clin Cancer Res， 2002， 8(3):752-758.

[11]Givalos N， Gakiopoulou H， Skliri M， et al. Replication protein A is an independent prognostic indicator with potential therapeutic implications in colon cancer[J]. Mod Pathol， 2007， 20(2):159-166.

[12]Shen L， Kondo Y， Rosner GL， et al. MGMT promoter methylation and field defect in sporadic colorectal cancer[J]. J Natl Cancer Inst， 2005， 97(18):1330-1338.

[13]Levidou G， Gakiopoulou H， Kavantzas N， et al. Prognostic significance of replication protein A (RPA) expression levels in bladder urothelial carcinoma[J]. BJU Int， 2011， 108(2 Pt 2):E59-65.

[14]Dahai Y， Sanyuan S， Hong L， et al. A relationship between replication protein A and occurrence and prognosis of esophageal carcinoma[J]. Cell Biochem Biophys， 2013， 67(1):175-180.

編輯/哈濤