婦科灌腸Ⅱ號對異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞核因子κB表達(dá)的影響

摘要：目的觀察核因子κB在各種干預(yù)條件下在離體培養(yǎng)的人異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)，探討NF-κB與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以及中藥婦科灌腸Ⅱ號治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效機(jī)理。方法將第3~7代人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞種植到Transwell 培養(yǎng)板上與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)，并進(jìn)行干預(yù)。通過RT-PCR法檢測在各種干預(yù)條件下，NF-κB在EM患者內(nèi)膜細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果在各種干預(yù)條件下，NF-κB mRNA在異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中有不同程度表達(dá)，差異有顯著性（P＜0.01）。結(jié)論核因子κB與子宮內(nèi)膜異位癥有顯著關(guān)系，中藥婦科灌腸Ⅱ號對子宮內(nèi)膜異位癥的療效機(jī)制可能與NF-κB信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：NF-κB；中藥；Caco-2細(xì)胞模型；子宮內(nèi)膜異位癥

核因子κB（NF-κB）是種能夠與多種細(xì)胞基因的啟動子或增強(qiáng)子特異結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)。免疫、炎癥、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等都會受其調(diào)控。目前內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確，越來越多的研究表明，NF-κB信號途徑的活化在EM中起重要作用。很多因素能激活NF-κB信號通路，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是其中重要的一種。TNF-α是由活化的巨噬細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞炎性因子，已有研究表明[1]，TNF-α在EM患者的腹腔液中明顯升高，提示TNF-α與EM的發(fā)生有一定關(guān)系。同時NF-κB信號通路被激活，并呈過度表達(dá)狀態(tài)，參與EM的發(fā)生、發(fā)展，說明TNF-α介導(dǎo)的NF-κB的活化與EM發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

為探討婦科灌腸Ⅱ號治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效機(jī)理，本實驗以NF-κB為檢測指標(biāo)，設(shè)空白組為對照組，TNF-α組為干預(yù)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞、激活NF-κB通路，中藥組為驗證中藥婦科灌腸Ⅱ號的治療效果，TNF-α+中藥組為深入研究中藥治療內(nèi)異癥的作用機(jī)理。通過RT-PCR法，檢測在各種干預(yù)條件下NF-κB在EM患者內(nèi)膜細(xì)胞中的mRNA表達(dá)。探討EM與NF-κB的關(guān)系，并對中藥婦科灌腸Ⅱ號治療子宮內(nèi)膜異位癥的機(jī)理進(jìn)行研究。

1資料與方法

1.1一般資料 DMEM/F12培養(yǎng)液（Hyclone），胎牛血清（NQBB），青-鏈霉素雙抗液（Gibco），0.25%胰蛋白酶溶液-EDTA（BIOTOPPED），PBS磷酸鹽緩沖液（索來寶）。PCR試劑：Trizol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑（Invitrogen），Super Real Pre Mix（北京天根生化科技有限公司）。TNF-α（PROSPEC）。婦科灌腸Ⅱ號凍干粉，天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究中心提供。Caco-2細(xì)胞株，購于北京協(xié)和醫(yī)院腫瘤所。

1.2儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），BCN-1360型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），CKX31型倒置顯微鏡（Olympus），血球計數(shù)板（上海精密儀器儀表有限公司），Transwell○R培養(yǎng)板、離心管（Corning），細(xì)胞電阻儀（Millipore），高速離心機(jī)、移液器，（Eppendorf），熒光定量PCR儀、電泳槽、ChemiDocTM XRS+成像系統(tǒng)（Bio-Rad），制冰機(jī)（北京長流科學(xué)儀器有限公司），漩渦震蕩儀（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3方法

1.3.1干預(yù)細(xì)胞 Transwell培養(yǎng)板上層種Caco-2細(xì)胞，下層種離體培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后對其進(jìn)行干預(yù)。實驗共分四組，每組3個復(fù)孔。空白組：上層加不完全FD培養(yǎng)液0.5mL，下層加不完全FD培養(yǎng)液1mL；TNF-α干預(yù)組：上層加不完全FD培養(yǎng)液0.5mL，下層加0.1μg/LTNF-α溶液[2]1 mL；中藥組：上層加0.1 mg/mL[3]中藥溶液0.5 mL，下層加不完全FD培養(yǎng)液1 mL；TNF-α+中藥組，上層加0.1 mg/mL中藥溶液0.5 mL，下層加0.1 μg/LTNF-α溶液1 mL。實驗后收集所有上清液并分裝、標(biāo)記。PBS沖洗下層子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞2遍，凍存-20℃冰箱中，統(tǒng)一檢測。

1.3.2 RT-PCR法檢測婦科灌腸II號經(jīng)Caco-2細(xì)胞吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)成分，對離體培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜細(xì)胞NF-κB P65的mRNA表達(dá)的影響

采用一步抽提法提取細(xì)胞mRNA，置于-80℃凍存?zhèn)溆?。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，加入3 μg的總RNA，65℃加熱5 min，37℃孵育50 min，70℃反應(yīng)15 min為反應(yīng)條件，反應(yīng)所得cDNA模板可立即使用，或-20℃凍存?zhèn)溆谩Ｒ訥APDH為內(nèi)參，上游5'GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3'，下游5'CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3'，NF-κB為上游5'GTGGGGACTACGACCTGAATG-3'，下游5'GGGGCACGATTGTCAAAGATG-3'，引物均由美國Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)體系為：2×SuperReal PreMix10 μL，正向引物（10μM）0.2 μL，反向引物（10μM）0.2 μL，cDNA模板1.0μL，RNase-free ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序為：95℃，10sec，變性；60℃，20sec，退火；72℃，20 sec，延伸；共40個循環(huán)。

1.3.3統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，多組間樣本均數(shù)的比較采用One way ANOVA法。

2結(jié)果

2.1鏡下觀察各種干預(yù)下細(xì)胞變化 顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，TNF-α組與空白組比較，變化不明顯，細(xì)胞數(shù)相對增多一些；中藥組可見明顯的細(xì)胞碎片，但是細(xì)胞數(shù)仍然很多而且貼壁；TNF-α+中藥組與其他組相比，細(xì)胞碎片更明顯，而且有細(xì)胞脫落漂浮，見圖1~4。

圖1 空白組 圖2 中藥組

圖3 TNF-α組圖4 TNF-α+中藥組

2.2異位子宮內(nèi)膜中NF-κB mRNA表達(dá)情況，見表1。

各組異位細(xì)胞中均有NF-κB mRNA的表達(dá)。TNF-α組表達(dá)最高，TNF-α+中藥組NF-κB mRNA的表達(dá)最低。各組與空白組比較有顯著差異（P＜0.01），TNF-α組與TNF-α+中藥組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3討論

婦科灌腸Ⅱ號為韓冰教授根據(jù)\"活血化瘀，軟堅散結(jié)\"的原則，研制的由丹參、三棱、莪術(shù)、乳香、沒藥、水紅花子組成的純中藥制劑，用于子宮內(nèi)膜異位癥的治療。中藥灌腸治療具有使藥效直達(dá)病所，避免藥物受胃腸酸堿消化液和消化酶的影響，是臨床治療EM較理想的方法之一。為了準(zhǔn)確、客觀的了解經(jīng)直腸吸收的中藥對EM盆腔病灶的作用，盡量排除干擾因素，本實驗將以Caco-2細(xì)胞模型作為研究中藥經(jīng)直腸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的工具，探索中藥直腸給藥對EM異位病灶生物行為的影響。

Caco-2細(xì)胞單層近年來在中藥吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究中被廣泛應(yīng)用。它來源于人類結(jié)、直腸，其屏障特性與結(jié)、直腸上皮細(xì)胞更為相似，因此本實驗創(chuàng)新性的將其應(yīng)用于中藥直腸轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收的研究。具體做法是，在Caco-2細(xì)胞的對數(shù)生長期，將其按8×104/ml密度接種于Transwell○R培養(yǎng)板上[4]，在細(xì)胞接種19到21天，用細(xì)胞電阻儀測定跨上皮細(xì)胞電阻，一般為300~500Ω，這時可將子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞種在Transwell?培養(yǎng)板上共培養(yǎng)。

本實驗通過RT-PCR法，檢測TNF-α干擾前后人異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞NF-κB mRNA表達(dá)的變化，得到NF-κB mRNA在TNF-α干擾后表達(dá)升高的結(jié)論，由此說明有可能是TNF-α對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的干預(yù)激活了NF-κB信號通路。通過觀察婦科灌腸Ⅱ號對TNF-α干預(yù)的NF-κB信號通路的影響，說明中藥婦科灌腸Ⅱ號對NF-κB信號通路可能有抑制作用。

目前我們對參與EM的諸多因素如何相互影響尚不清楚，TNF-α如何誘導(dǎo)NF-κB mRNA表達(dá)增加、中藥婦科灌腸Ⅱ號如何作用于TNF-α以限制其作用的發(fā)揮，均有待深入探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]Kyama CM Overbergh L， Debrock S， etal. Increased peritoneal and endometrial gene expression of biological relevant cytokines and growth factors during the menstrual phase in women with endometriosis[J].Fertil Steril，2006，85(6):1667-1675.

[2]王建軍，李懷芳，廖小玲.TNF-α對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響[J].生殖與避孕，2007，27(7):450-453.

[3]李沛霖，王盼盼，趙志梅，等.基于Caco-2細(xì)胞的中藥直腸吸收機(jī)制研究[J].天津中醫(yī)藥，2013，30(9):555-556.

[4]楊秀偉，楊曉達(dá)，王瑩，等.中藥化學(xué)成分腸吸收研究中Caco-2細(xì)胞模型和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的建立[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2007，l5(6):634-641.編輯/張燕