esp1基因Tet-on載體的構(gòu)建及在Hela中的可調(diào)控性表達(dá)

摘要：目的構(gòu)建esp1- pTRE-d2EGFP可調(diào)控真核表達(dá)載體，檢測其在Hela 細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。方法將esp1導(dǎo)入pTRE-d2EGFP載體中。用脂質(zhì)體將pTet-on、PTK-Hyg 和esp1-pTRE-d2EGFP共轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞， 以不同濃度的DOX誘導(dǎo)， 用Real-time PCR、Western blot檢測esp1表達(dá)水平。結(jié)果我們構(gòu)建的可調(diào)控性表達(dá)載體能在Hela細(xì)胞內(nèi)表達(dá)， 不同濃度藥物誘導(dǎo)的esp1表達(dá)水平明顯不同。結(jié)論成功構(gòu)建了esp1- pTRE-d2EGFP真核表達(dá)載體， 并可在Hela細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。為進(jìn)一步觀察esp1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：esp1；Hela ；pTet-on；PTK-Hyg ；esp1-pTRE-d2EGFP

中圖分類號：R392.12 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

esp1基因表達(dá)一種分離酶(separase) 在遺傳信息的傳遞中發(fā)揮重要作用。我們以esp1為靶基因構(gòu)建一種可調(diào)控的真核表達(dá)載體， 以實現(xiàn)人為控制的esp1的表達(dá)[1，2]。本研究應(yīng)用Tet-on系統(tǒng)調(diào)控esp1的表達(dá)，在低于DOX毒性劑量時就可以發(fā)揮誘導(dǎo)作用。其可控性、高表達(dá)效率和低表達(dá)背景特征，已成為研究基因功能、進(jìn)行疾病基因治療的有力武器[3]。為將來應(yīng)用于動物模型， 方便快捷地研究分離酶在腫瘤細(xì)胞過度增殖中的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料Hela，PSK-esp1質(zhì)粒，pTet-on、PTK-Hyg 、pTRE-d2EGFP（購自Clontech 公司），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone美國），小牛血清（蘭州民海生物），Tipure（Roch公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司），PCR試劑（寶生物公司），引物（Invitrogen公司），強(qiáng)力霉素(DOX)（深圳晶美生物有限公司）。

1.2方法

1.2.1 Tet-on 系統(tǒng)esp1表達(dá)調(diào)控模型的構(gòu)建

1.2.1.1 esp1目的基因片段的獲得載體PSK-esp1質(zhì)粒用EcoR Ⅰ， Sac Ⅱ雙酶，膠純化回收試劑盒回收純化6662bp的目的片段。

1.2.1.2 esp1-pTRE-d2EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建利用T4DNA連接酶連入EcoR Ⅰ單酶切后的pTRE-d2EGFP載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)菌，利用青霉素平板篩選，挑取單個菌落用LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，抽取質(zhì)粒酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送上海英駿公司測序驗證。

1.2.1.3 PTet-on 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染前將6 孔板中Hela細(xì)胞的培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)液，選擇如下轉(zhuǎn)染比率3∶1、3∶2、6∶1;無血清培養(yǎng)基97、97、94μl;轉(zhuǎn)染試劑3、3、6μl 待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒1、2、1μg。最后將混合試劑室溫放置15～45min，滴入待轉(zhuǎn)染的已換無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染8h 后換新鮮有血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24h 后加G418 (200ng/ml)，篩選2w后挑選單個細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.1.4 PTK-Hyg 質(zhì)粒和esp1-pTRE-d2EGFP質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染將轉(zhuǎn)染pTet-on 質(zhì)粒成功的Hela細(xì)胞克隆傳入6孔板，細(xì)胞密度為1×105 個/ml。篩選2w后挑選單個細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 Real-time PCR檢測DOX誘導(dǎo)下Tet-on 系統(tǒng)調(diào)控esp1的表達(dá)

1.2.2.1 DOX半衰期為24h，有效濃度為100~1000 ng/ml，撤藥5d后表達(dá)恢復(fù)原來水平；

1.2.2.2細(xì)胞RNA 提??；

1.2.2.3 RNA 逆轉(zhuǎn)錄 cDNA；

1.2.2.4定量PCR反應(yīng)①構(gòu)建反應(yīng)體系；②標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；③數(shù)據(jù)處理。

實驗數(shù)據(jù)用C(T)及拷貝/μl表示，實驗組和對照組測得拷貝數(shù)均除以各自內(nèi)參，結(jié)果采用SPSS10.0軟件獨立樣本t檢驗分析，P<0.05表示差異具有顯著性意義，P<0.01表示差異具有非常顯著性意義。

1.2.3 WB檢測強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下Tet-on系統(tǒng)調(diào)控分離酶的表達(dá) ①細(xì)胞總蛋白的提取；②SDS－PAGE電泳；③轉(zhuǎn)膜；④免疫反應(yīng)。

1.2.4 Hela細(xì)胞染色體的制備①細(xì)胞生長至覆蓋瓶底面積70%時加入秋水仙素，使終濃度為40ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h。②棄培養(yǎng)基，用PBS 洗1次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，172.5×g離心6min，棄上清。③加入預(yù)熱至37℃的0.075mol/L低滲液KCl，至10ml，混勻， 37 ℃低滲處理20min，172.5×g離心6min，去上清。④加固定液甲醇-冰醋酸(3:1)至10 ml，混勻，固定30 min，然后172.5×g離心6min，棄上清。⑤重復(fù)2~3次，固定30min/次。⑥固定完畢，加入0.2ml 固定液，制成懸液，滴一滴在冰冷的玻片上，酒精燈外焰烤干，72℃烤箱2~3h。⑦姬姆莎染色，加入適量的碳酸氫鈉溶液10min，清水沖洗，晾干。

2結(jié)果

2.1 Tet-on系統(tǒng)esp1表達(dá)調(diào)控模型的鑒定

2.1.1 esp1-pTRE-d2EGFP構(gòu)建質(zhì)粒電泳鑒定采用XhoⅠ，SphⅠ雙酶切鑒定插入方向，若正向插入則片段為8520bp/2100bp，若反向插入則片段為5800bp/4820bp，酶切鑒定結(jié)果如圖為正向插入，見圖1。

1:λDNA HindIII marker(23130/9416/6557/4361/2322/2027/564/125bp，from up to down);2:esp1-pTRE-d2EGFP/ XhoⅠ＋ SphⅠ

圖1含esp1片段的esp1-pTRE-d2EGFP載體的酶切鑒定

2.1.2 esp1-pTRE-d2EGFP構(gòu)建質(zhì)粒PCR鑒定在esp1目的基因片段上設(shè)計引物，F(xiàn)P:5'TGCTACCACGACTTTACGC3'，RP:5' AACGATCTTCCTGGAGTT

TAT 3'。已構(gòu)建質(zhì)粒為模板，PCR，電泳，目的條帶大小約274bp，與預(yù)期相符，見圖2。

1：200bp DNA ladder，（4000/2200/2000/1800/1600/1400/1200/1000/800/600/400/200bp，from up to down）；2：esp1-pTRE-d2EGFP with PCR amplification

圖2含esp1片段的esp1-pTRE-d2EGFP載體的PCR擴(kuò)增電泳鑒定

2.2Real-time PCR檢測強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下Tet-on系統(tǒng)調(diào)控分離酶的表達(dá)，見表1。

2.3 WB檢測強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下Tet-on 系統(tǒng)調(diào)控分離酶的表達(dá)，見圖3。

圖3 WB檢測esp1基因在Hela細(xì)胞中的表達(dá)

（1：Hela細(xì)胞；2、3、4、5、6：pTet-on-esp1- Hela細(xì)胞）（DOX濃度依次0/0/100/200/400/800ng/ml）

2.4.Hela細(xì)胞染色體結(jié)果

2.4.1染色體的形態(tài)秋水仙素法處理人淋巴細(xì)胞及經(jīng)過DOX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染前后的Hela細(xì)胞，制備染色體，見圖4。

A：淋巴細(xì)胞； B：Hela細(xì)胞； C：pTet-on-Hela細(xì)胞；

D：pTet-on-esp1-Hela細(xì)胞

圖4轉(zhuǎn)染前后染色體分裂相（姬姆薩染色×1000）

2.4.2染色體的數(shù)目DOX濃度以最適誘導(dǎo)濃度200ng/ml誘導(dǎo)后，對正常人淋巴細(xì)胞、Hela細(xì)胞、pTet-on-Hela細(xì)胞染色體影響不明顯(P>0.05)，對pTet-on-esp1-Hela細(xì)胞染色體影響顯著（P<0.01），見表2。

3討論

esp1的結(jié)構(gòu)具有進(jìn)化保守性，其表達(dá)的活性蛋白在姐妹染色單體的分離中發(fā)揮重要作用。esp1基因定位于VII號染色體，多數(shù)為高分子蛋白質(zhì)，是高度水溶性蛋白，約150-230kDa[4]。

我們成功構(gòu)建了esp1基因的真核表達(dá)載體esp1-pTRE-d2EGFP， 并轉(zhuǎn)染進(jìn)Hela細(xì)胞。通過不同濃度的DOX誘導(dǎo)該表達(dá)載體，觀察到最適的DOX誘導(dǎo)濃度為200ng/ml。以該濃度誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞后， esp1表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞染色體數(shù)目降低[5，6]。這一結(jié)果初步提示，分離酶表達(dá)增加，Hela細(xì)胞染色體數(shù)目減少，惡性程度降低。本實驗中構(gòu)建的esp1-pTRE-d2EGFP載體為進(jìn)一步建立轉(zhuǎn)esp1基因動物模型， 探討esp1對腫瘤細(xì)胞增殖作用的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1]Irene C. Waizenegge， Hauf S， Meinke A et al. Two Distinct Pathways Remove Mammalian Cohesin from Chromosome Arms in Prophase and from Centromeres in Anaphase cell[J].2000 103:399-410.

[2]Díaz-Martínez LA， Giménez-Abián JF， Clarke DJ. Cohesin is dispensable for centromere cohesion in human cells[J].PLoS ONE，2007，2(3):e318.

[3]Schmeisser F， DonohueM， Weir JP. Tetracycline-regulated gene expression in rep- lication-incompetent herpes simp lex virus vectors [J].Hum Gene Ther， 2002， 13 (18) : 2113 - 3124.

[4]Chestukhin A，Pfeffer C，Millig S， et al. Processing， localization， and requirement of human separase for normal anaphase progression[J].PNAS，2003，100(8):4574-4579.

[5]Losada A. Cohesin regulation: fashionable ways to wear a ring[J].Chromosoma. 2007 Aug;116(4):321-9. Epub 2007 Mar 1. Review.

[6]Uhlmann F. Secured cutting: controlling separase at the metaphase to anaphase transition[J].EMBO reports 2001 6:487-492.

編輯/申磊