吲哚美辛抑制大鼠子宮內(nèi)膜異位癥微血管形成的實(shí)驗(yàn)研究

摘要：目的研究吲哚美辛對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥微血管的影響。方法建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型。隨機(jī)分組：治療組喂服吲哚美辛(5mg·kg-1·d-1)，對(duì)照組給予相應(yīng)體積溶劑(0.2%二甲亞砜-生理鹽水溶液)。4w后處死動(dòng)物，采用免疫組化法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中微血管密度(MVD)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，兔抗大鼠CD34標(biāo)記微血管。結(jié)果子宮內(nèi)膜體積治療組和對(duì)照組MVD分別為15±3和27±5(P<0.05)，VEGF的表達(dá)強(qiáng)度分別為1.4±0.8和3.5±1.1(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)未見明顯毒性反應(yīng)。結(jié)論吲哚美辛能通過抑制子宮內(nèi)膜微血管形成治療子宮內(nèi)膜異位癥，其機(jī)制可能與抑制VEGF的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：吲哚美辛；子宮內(nèi)膜；血管生成；微血管密度；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

持續(xù)的血管生成是子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素，新生血管為子宮內(nèi)膜細(xì)胞提供增殖所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及各種生長(zhǎng)因子。據(jù)此，Shifren在1996年首次提出抑制子宮內(nèi)膜的血管形成可作為治療子宮內(nèi)膜異位癥的一種手段[1]。吲哚美辛是一種非甾體抗炎藥，近年來大量研究資料表明，吲哚美辛可有效降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)，減少微血管密度(MVD)[2，3]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型為研究對(duì)象，觀察吲哚美辛對(duì)子宮內(nèi)膜及其新生血管的影響。

1資料與方法

1.1一般資料吲哚美辛（美國(guó)Sigma公司）、二甲基亞砜(DMSO)（美國(guó)MPBIO公司）。吲哚美辛溶于DMSO中，應(yīng)用前臨時(shí)避光配制。健康成熟未交配雌性Wistar大鼠(60d～70d)，每只體重190g～240g(由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。兔抗大鼠CD34和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品，ABC試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型參考Zulfikaroglu[4]方法，選用成熟雌性Wistar大鼠，切取子宮角組織一塊，分離出內(nèi)膜組織并將其縫合在腹膜上，子宮內(nèi)膜面向腹腔。

1.3實(shí)驗(yàn)分組模型手術(shù)后3w，第2次開腹，將造模成功者隨機(jī)分為兩組(5只/組)：治療組用灌胃法每日喂服吲哚美辛(5mg·kg-1·d-1)；對(duì)照組喂服0.2%的DMSO-生理鹽水液。連續(xù)喂服4w。

1.4免疫組織化學(xué)染色每只大鼠在治療結(jié)束后24 h內(nèi)處死，立即手術(shù)取異位內(nèi)膜組織，常規(guī)處理，10％多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)切片(5μm)，行CD34和VEGF免疫組織化學(xué)染色。CD34和VEGF染色均采用ABC法（卵白素-生物素-酶復(fù)合物染色法），參照試劑盒說明逐步操作。各組標(biāo)本同一批染色，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

子宮內(nèi)膜微血管密度(MVD)計(jì)算方法：CD34標(biāo)記微血管，計(jì)數(shù)子宮內(nèi)膜內(nèi)著色的毛細(xì)血管和微小血管。參考Guset[5]的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，凡呈現(xiàn)棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為1個(gè)血管計(jì)，但肌層較厚及管腔面積大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管不計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法，首先用10×10低倍鏡頭掃視整張切片，確定微血管最密集的3個(gè)視野(新生血管熱點(diǎn)區(qū))，然后在高倍鏡(10×40)視野范圍內(nèi)計(jì)數(shù)所有染色的微血管。取3個(gè)視野計(jì)數(shù)結(jié)果的均數(shù)為該切片的微血管數(shù)。

VEGF判斷標(biāo)準(zhǔn)：VEGF蛋白表達(dá)均以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。參考Guset[5]的方法判斷染色結(jié)果，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級(jí)，并分別計(jì)分：陰性為細(xì)胞無著色(0分)；弱陽(yáng)性為淺黃(1分)；中度陽(yáng)性為棕黃(2分)；強(qiáng)陽(yáng)性為棕褐(3分)。在每張切片上隨機(jī)選取10個(gè)視野(10×10)，計(jì)數(shù)每一強(qiáng)度視野數(shù)所占的比率(F)，根據(jù)下列公式計(jì)算每張切片的平均染色強(qiáng)度。IS(intensity score)=∑[(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)]，F(xiàn)=10×視野%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。兩組均數(shù)比較分別采用Student's t-test。

2結(jié)果

子宮內(nèi)膜組織內(nèi)MVD及VEGF表達(dá)CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，所有子宮內(nèi)膜組織均有陽(yáng)性表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色，微血管有的形成管腔，有的僅為單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇(圖1)。治療組內(nèi)膜組織中MVD明顯少于對(duì)照組(P<0.05)。內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞均有VEGF表達(dá)，而間質(zhì)細(xì)胞中散在表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)(圖2)。治療組與對(duì)照組比較，VEGF表達(dá)有顯著差異(P<0.05)，見表1。

圖1 CD34標(biāo)記微血管(ABC法，×400)

圖2 VEGF表達(dá)于子宮內(nèi)膜細(xì)胞胞質(zhì)(ABC×400)

3討論

新生血管形成在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。人們逐漸將注意力集中在血管生成的生物學(xué)基礎(chǔ)上，研究減弱血管生成的介質(zhì)，尋求抑制血管生成治療子宮內(nèi)膜異位癥的治療方案。VEGF是目前已知最主要的血管生成因子，在機(jī)體生理性和病理性血管生成過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，可選擇性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶受體，通過磷酸肌醇特異性磷脂酶C使細(xì)胞內(nèi)IP3濃度升高而發(fā)揮作用，從而促進(jìn)不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖和血管構(gòu)建，促使內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管內(nèi)物質(zhì)的滲漏，是阻斷子宮內(nèi)膜血管生成比較理想的靶位[6，7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧合酶2(COX-2)在子宮內(nèi)膜異位癥的內(nèi)膜表達(dá)增高，與該病密切相關(guān)[8]。COX-2可通過抑制細(xì)胞凋亡途徑促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位病灶的生長(zhǎng)，主要是通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白和促凋亡酶的表達(dá)來起作用;COX-2還可通過血管生成途徑促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，這種作用是基于提高促血管生成因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的[8]。Ebert等[9]提出使用COX-2抑制劑有望治療子宮內(nèi)膜異位癥。 Jones等[10]證實(shí)吲哚美辛和NS-398(選擇性COX-2抑制劑)在體外可抑制3種不同的血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管，提示COX-2在體外血管形成過程中起到關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)選用吲哚美辛(非選擇性COX-1和COX-2抑制劑)治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥，通過免疫組化染色檢測(cè)MVD和VEGF，結(jié)果顯示治療組子宮內(nèi)膜組織中的微血管明顯比對(duì)照組減少，治療組VEGF的表達(dá)也顯著減少。由此得出結(jié)論：吲哚美辛可減少子宮內(nèi)膜中新生血管的生成，其機(jī)制與直接或間接抑制血管生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)有關(guān)。大量研究表明，吲哚美辛等NSAIDS可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而抑制新生血管生成[11-14]。

吲哚美辛為吲哚類非甾體抗炎藥，由美國(guó)默克（merck）公司最先研制，早在1963年就被推薦到臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。但由于它有嚴(yán)重的副作用，尤其不適于高齡患者和有胃潰瘍及高血壓的患者，其對(duì)胃粘膜的副作用主要是由于抑制胃粘膜的COX-1并阻礙肉芽組織血管生成[15]，誘發(fā)潰瘍性疾病，影響潰瘍愈合。因此，有必要進(jìn)一步探討非甾體抗炎藥影響生理性與病理性血管生成的確切機(jī)制，加強(qiáng)對(duì)此類藥物功能及副作用機(jī)制的了解，提高藥物應(yīng)用的安全性和有效性。

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編輯/申磊