脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植物組織相容性初探

摘要：目的探討脫細(xì)胞大鼠坐骨神經(jīng)的組織相容性。方法應(yīng)用低滲脫細(xì)胞方法制備脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植物-脫細(xì)胞大鼠坐骨神經(jīng)(Acellular Rat Sciatic Nerve，ARSN)，進(jìn)行組織學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)方法檢測，肌肉埋植術(shù)后分別于第4d和第7d進(jìn)行其組織相容性分析。結(jié)果①ARSN保存了雪旺細(xì)胞基底膜管以及神經(jīng)外膜和束膜的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，清除了軸突、髓鞘及雪旺細(xì)胞神經(jīng)外膜和束膜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。②肌肉埋植后第4d，ARSN神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu)吸收明顯，周圍出現(xiàn)由新生肉芽組織構(gòu)成的環(huán)狀包繞；第7d，ARSN神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu)已被吸收，周圍肉芽組織趨于成熟，無淋巴細(xì)胞。③免疫組織化學(xué)法檢測FN和LN可見ARSN基底膜管壁分別呈棕黃色和黃色，但較NRSN陽性略弱。結(jié)論采用低滲脫細(xì)胞方法制備的周圍神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)支架保留了對(duì)神經(jīng)再生具有促進(jìn)作用-FN和LN，具有良好的組織相容性，可隨著時(shí)間的推移逐漸降解。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)組織工程；脫細(xì)胞神經(jīng)異體移植物；神經(jīng)再生；大鼠

Acellular Allogenic Nerve Graft Tissue Biocompatibility Study

SUN Hui-zhe1，ZENG Liang1，TIAN Wei1，WANG Xiao-jie1，TONG Xiao-jie2

(1.Department of Human Anatomy，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，Liaoning，China;2.Department of Human Anatomy，China Medical University，Shenyang 110001，Liaoning，China)

Abstract：ObjectiveTo explore histocompatibility of acellular rat sciatic nerve.MethodsPrepared acellular rat sciatic nerve(ARSN) with hypotonic acellular treatment. Histological observation and examined by immunohischemical method. Ananlyzed histocompatibility after implantation in muscle respectively.Results①ARSN reserved basement membrane tube of SC(Schwann cells) and ECM(extracellular matrix) of epineurium and perineurium， while axis-cylinder， myelin sheath and cell structure of epineurium and perineurium were cleared away. ②Histological observation of ARSN after implantation in muscle. After HE staining showed: on the 4th day， epineurium left in ARSN group was absorbed obviously. Also， a ring structure formed of new-born granulation tissue surrounded ARSN. On 7th day of implantation， epineurium left in ARSN was absorbed completely and granulation tissue tended to be mature. And we saw no lymphocyte. ③Examination of laminin(LN) and fibronectin(FN) by immunohistochemical method， We could see that basement membrane was yellow or brown showing positive reaction. ConclusionThe cytoskeletal of acllular peripheral ECM we prepared reserved important components of ECM of nerve tissue which might promote nerve regeneration， LN and FN. They had good histocompatibility and would be degraded with time flies.

Key words：Nerve tissue-engineering; Acellular peripheral nerve allograft;Nerve regeneration;Rat

周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)、再生和功能重建目前仍然是創(chuàng)傷外科的難題之一。近年來，隨著周圍神經(jīng)組織工程的日漸發(fā)展，由雪旺細(xì)胞(Schwann cell， SC)為核心，具有良好促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的生物可降解材料為支架，能支持SC存活和再生的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix， ECM)為復(fù)合劑，SC、生物材料和生物基質(zhì)三個(gè)核心要素的有機(jī)結(jié)合構(gòu)成了周圍神經(jīng)組織工程的基礎(chǔ)[1]。ECM是去除細(xì)胞后的所有組織成分，是細(xì)胞附著的基本框架，具有連接和支持細(xì)胞的作用，也是細(xì)胞的代謝場所，其形態(tài)和功能直接影響所構(gòu)成組織形態(tài)和功能[2]。目前，天然的ECM已成功用于研制人工皮膚[3]，并對(duì)血管、骨、軟骨、心包、膀胱等做了大量研究，為應(yīng)用天然ECM設(shè)計(jì)人工神經(jīng)替代物提供了理論基礎(chǔ)和新的研究思路。

本研究成功制備脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植物-脫細(xì)胞大鼠坐骨神經(jīng)(Acellular Rat Sciatic Nerve， ARSN)，并采用肌肉埋植的方法觀察其組織相容性，為臨床篩選組織相容性良好的周圍神經(jīng)ECM做為移植支架提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑Wistar大鼠（體重180～200g），分為實(shí)驗(yàn)組35只，正常對(duì)照組35只。

TritonX-100，PepstatinA（Sigma公司），牛胰脫氧核糖核酸酶（DNase）、牛胰核糖核酸酶（RNase）（華美生物工程公司），三羥甲基胺基甲烷（Tris，美國Gibco公司），Aprotinin，Leupeptin， Fibronectin（FN）、Laminin（LN）抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 ARSN的制備采用組織工程化低滲脫細(xì)胞方法。取Wista大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，Tris-HCl緩沖液中浸泡，利用低滲作用脹破雪旺細(xì)胞、神經(jīng)外膜及束膜等的細(xì)胞；使用TritonX-100、蛋白酶抑制劑(0.1μg/ml aprotinin，0.5μg/ml leupeptin，0.6μg/ml pepstatinA)、DNase、RNase等藥品，按照一定的步驟和時(shí)間，在適當(dāng)?shù)臏囟?、pH下，對(duì)坐骨神經(jīng)進(jìn)行脫細(xì)胞處理；

1.3組織學(xué)觀察ARSN與NRSN用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察。取兩例ARSN用4％多聚甲醛和0.5％戊二醛混合固定液固定，鋨酸后固定，制成掃描電鏡樣本，電鏡觀察。

1.4免疫組織化學(xué)法（鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結(jié)法）檢測LN和FNⅠ抗為兔抗鼠Fibronectin和Laminin抗體。PBS沖洗ARSN和NRSN，滴加3%的H2O2-甲醇15min。PBS 沖洗，滴加第一抗體，4℃過夜。第2d用PBS沖洗，加入第二抗體（生物素化羊抗鼠IgG），室溫下1h。PBS沖洗2次，室溫下加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶溶液1h。DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，光鏡觀察。

1.5 ARSN的肌肉埋植分別取ARSN和NRSN埋植于大鼠股四頭肌內(nèi)。術(shù)后分別于第4、7d取出埋植物，周圍帶少量肌肉組織。10％的福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，橫切片，HE染色，光鏡觀察。

2結(jié)果

2.1 ARSN與NRSN的組織結(jié)構(gòu)差異HE染色光鏡觀察ARSN，可見橫切面呈網(wǎng)狀，髓鞘、軸突均已經(jīng)消失，僅見雪旺細(xì)胞基底膜，未見雪旺細(xì)胞核，神經(jīng)外膜、束膜內(nèi)未見細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖1、2）；縱切面可見基底膜呈典型的長空管狀，雪旺細(xì)胞核、軸突和髓鞘均已消失，神經(jīng)外膜、束膜中也未見細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖3、4）。掃描電鏡觀察，ARSN的軸突和髓鞘已經(jīng)消失，僅可見空虛的基底膜管，與NRSN有明顯的差異（圖5，6）。

2.2免疫組織化學(xué)法檢測LN和FN采用免疫組織化學(xué)法檢測ARSN內(nèi)的FN和LN，光鏡觀察可見基底膜管壁呈棕黃色、黃色的FN和LN陽性反應(yīng)，說明脫細(xì)胞處理后，F(xiàn)N和LN的成分仍保留于基底膜管上，但與NRSN比較，陽性較弱，說明有少部分細(xì)胞外基質(zhì)成分在脫細(xì)胞的過程中也被脫掉（圖8-10）。

2.3 ARSN肌肉埋植后的組織學(xué)觀察ARSN埋植大鼠股四頭肌后取材，經(jīng)HE染色，組織學(xué)觀察：埋植第4d，ARSN組周圍有炎性細(xì)胞浸潤，并有大量新生的毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞（圖13），剩余的神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu)吸收明顯（圖11），新生肉芽組織環(huán)形包繞在ARSN的周圍（圖11）；NRSN組周圍有炎性細(xì)胞浸潤，有新生的毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞（圖14），但神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu)完整（圖12）。

埋植第7d，ARSN周圍的肉芽組織趨于成熟，新生毛細(xì)血管減少，成纖維細(xì)胞增多，剩余的神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu)已被吸收（圖15），未見淋巴細(xì)胞（圖17）；NRSN周圍的成纖維細(xì)胞增多，肉芽組織趨于成熟（圖18），神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu)仍保持完整（圖16）。

3討論

周圍神經(jīng)損傷，尤其是長段缺損的修復(fù)一直是神經(jīng)外科學(xué)關(guān)注的前沿課題之一。較早采用的幾丁質(zhì)管、硅膠管、Dacron管等其生物相容性差；而近年來，PLA、PGA、PLGA等的研究，雖較傳統(tǒng)管材有了進(jìn)步，但缺乏神經(jīng)再生的微環(huán)境條件，還有排斥反應(yīng)和繼發(fā)感染的可能；其他研究中采用過的膠原、FN、LN等細(xì)胞外基質(zhì)成分均缺乏真正意義的仿生性。

同種異體移植的主要問題是免疫排斥反應(yīng)，而核心問題是組織相容性復(fù)合體（MHC），其表達(dá)產(chǎn)物主要位于細(xì)胞膜表面，構(gòu)成多種細(xì)胞的膜抗原，是產(chǎn)生移植免疫的主要原因[7]。研究表明，含有FN、LN及Ⅳ型膠原蛋白等大分子物質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)幾乎沒有免疫原性。

采用低滲脫細(xì)胞方法制備同種異體神經(jīng)移植物，僅保留了雪旺細(xì)胞基底膜管的結(jié)構(gòu)，脫去了雪旺細(xì)胞、軸突和髓鞘，此過程被形象的稱為\"化學(xué)抽吸\"[4]。經(jīng)過這種方法處理的移植物已失去明顯的抗原性，能夠有效的促進(jìn)受體的雪旺細(xì)胞和軸突再生，且不會(huì)發(fā)生明顯的排異反應(yīng)。與反復(fù)冰凍融解等物理辦法制備的移植物相比較，其滲透性明顯優(yōu)于后者[5]。經(jīng)脫細(xì)胞處理后，F(xiàn)N和LN仍保留基底膜上。天然的神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)具有促進(jìn)軸突再生的作用[2]，與其所含的主要成分如FN、LN、硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)及Ⅳ型膠原蛋白等的生物學(xué)功能有關(guān)。其中LN的研究較多，認(rèn)為其是由A鏈和B1鏈與B2鏈共同構(gòu)成的十字架形結(jié)構(gòu)的多機(jī)能蛋白，不僅對(duì)神經(jīng)再生有明顯的引導(dǎo)和促進(jìn)作用，還可以為神經(jīng)再生提供良好的微環(huán)境條件[6]。

本研究采用低滲脫細(xì)胞的組織工程學(xué)的方法，制備出具有仿生性的三維立體結(jié)構(gòu)的天然神經(jīng)移植物，是一種天然的生物衍生材料，雖然優(yōu)化制備過程、植入后抗原性和組織相容性的進(jìn)一步檢測、ARSN與種子細(xì)胞三維聯(lián)合培養(yǎng)技術(shù)和裝置的研究等問題仍有待進(jìn)一步的深入摸索，但其可以作為周圍神經(jīng)組織填充物而長期存在、具有較好的組織相容性和親和性的優(yōu)點(diǎn)，使其具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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編輯/申磊