阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞體外增殖和缺氧誘導(dǎo)因子1α及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

王煥玲 魏志平 郭武 侯曉陽(yáng) 劉彥群

221002 江蘇，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科

阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞體外增殖和缺氧誘導(dǎo)因子1α及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

王煥玲 魏志平 郭武 侯曉陽(yáng) 劉彥群

221002 江蘇，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科

目的通過(guò)阿維A作用于缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，初步探討阿維A治療銀屑病的可能機(jī)制。方法將濃度為10-5、10-6、10-7、10-8mol/L的阿維A分別作用于HaCaT細(xì)胞，用CCK?8法檢測(cè)缺氧培養(yǎng)12、24、36 h對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖的影響。反轉(zhuǎn)錄PCR和Western印跡檢測(cè)不同濃度阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)24 h的HaCaT細(xì)胞HIF?1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）蛋白及mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果阿維A 10-8、10-7、10-6、10-5mol/L作用24 h，HaCaT細(xì)胞體外增殖抑制率分別為（13.31± 1.15）%、（21.86± 5.31）%、（32.05± 2.99）%、（37.28 ±3.21）%，且隨著缺氧培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)和阿維A濃度增加，對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)阿維A濃度為10-5mol/L時(shí)，HIF?1α蛋白的表達(dá)由1.196± 0.088降至0.319±0.180（P＜0.05），而HIF?1α mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯下降；VEGF mRNA的表達(dá)由1.108±0.073降至0.442±0.090（P＜0.05），VEGF蛋白的表達(dá)則由1.174±0.186降至0.216±0.066（P＜0.05）。結(jié)論阿維A可抑制缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞體外增殖，并在蛋白水平下調(diào)HIF?1α及VEGF的表達(dá)，在mRNA水平下調(diào)VEGF的表達(dá)。

阿維A；缺氧；缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基；內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；細(xì)胞增殖；HaCaT細(xì)胞

缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia?inducible factor?1，HIF?1）是1992年Semenza等發(fā)現(xiàn)的一種具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，可使細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，對(duì)氧供與能量穩(wěn)態(tài)起著重要作用［1］。HIF?1α是HIF?1的功能性亞基，具有廣泛的靶基因譜，其中包括與缺氧適應(yīng)，炎癥發(fā)展及腫瘤生長(zhǎng)等相關(guān)的近100種靶基因［2］。銀和惡性腫瘤都具有特征性的細(xì)胞過(guò)度增殖和局域性缺氧［1］，角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖可能導(dǎo)致氧需求增加，表皮肥厚、細(xì)胞數(shù)目增多也可能導(dǎo)致局部氧供給受損［2］。HIF?1α在銀屑病主要表達(dá)于表皮細(xì)胞、真皮淺層毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其周圍部分炎癥細(xì)胞胞質(zhì)，且進(jìn)行期皮損明顯高于靜止期，在mRNA及蛋白質(zhì)水平均呈顯著上調(diào)，提示HIF?1α與銀屑病的病情進(jìn)展有關(guān)［3］。有報(bào)道，HIF?1α只是在蛋白水平升高，而mRNA水平變化不明顯［4］。阿維A為第2代維A酸類衍生物。維A酸類藥物治療銀屑病與其對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過(guò)程的調(diào)控有關(guān)，對(duì)維A酸類藥物作用機(jī)制的研究表明其主要通過(guò)結(jié)合并激活維A酸核受體對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生作用，但具體作用機(jī)制尚未完全清楚［5］。我們研究了阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞體外增殖和HIF?1α及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的影響，試圖進(jìn)一步探討阿維A治療銀屑病的可能機(jī)制。

材料與方法

一、試劑

阿維A（重慶華邦制藥有限公司），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），兔抗人HIF?1α單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗人VEGF單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、馬抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），鼠抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（美國(guó)Bioworld公司），BCA試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），RT?PCR引物設(shè)計(jì)［生工生物工程（上海）股份有限公司］，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司），人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞（上海復(fù)祥生物科技有限公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組：HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，以含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，更換無(wú)血清、無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液，并加入不同濃度阿維A，置于37℃、1%O2缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HaCaT細(xì)胞分組處理如下：空白對(duì)照組；二甲基亞砜（DMSO）對(duì)照組；阿維A 10-8、10-7、10-6、10-5mol/L組。阿維A處理組缺氧培養(yǎng)24 h，空白對(duì)照組分別進(jìn)行0、12、24、36 h缺氧培養(yǎng)。阿維A以DMSO配制成濃度為10-1mol/L儲(chǔ)存液，-20℃避光保存，加藥時(shí)用無(wú)血清、無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度（DMSO濃度≤1‰）。與10-5mol/L阿維A所含等體積DMSO組為溶媒組。

2.CCK?8法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞體外增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞以9×103/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入含阿維A 10-5、10-6、10-7、10-8mol/L的培養(yǎng)基，與10-5mol/L阿維A所含等體積DMSO組為DMSO對(duì)照組，并設(shè)空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別缺氧培養(yǎng)12、24、36 h后終止培養(yǎng)，棄去原培養(yǎng)基，將無(wú)血清、無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)液與CCK?8試劑按10∶1比例混勻，每孔加入100 μl，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率=（1-阿維A處理組吸光度A值/對(duì)照組吸光度A值）×100%。

3.RT?PCR法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞HIF?1α、VEGF mRNA的表達(dá)：阿維A處理組各組細(xì)胞缺氧培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞總RNA，空白對(duì)照組分別進(jìn)行0、12、24、36 h缺氧培養(yǎng)后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，目的基因HIF?1α上游引物：5′?GCAAGTC CTCAAAGCACAGTT?3′，下游引物：5′?CTCAAAGCG ACAGATAACACG?3′，擴(kuò)增片段為311 bp。VEGF上游引物：5′?CATGAACTTTCTGCTGTCTTGG?3′，下游引物：5′?GGTCTGCATTCACATTTGTTGT?3′，擴(kuò)增片段為396 bp。內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白上游引物：5′?CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC?3′，下游引物：5′?TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT?3′，擴(kuò)增片段為241 bp。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。PCR反應(yīng)體系為25 μl，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，檢測(cè)各電泳條帶的灰度值，計(jì)算與β肌動(dòng)蛋白比值，得到目的產(chǎn)物的相對(duì)含量。

4.Western印跡法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞HIF?1α及VEGF的表達(dá)：阿維A處理組缺氧培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，空白對(duì)照組分別進(jìn)行0、12、24、36 h缺氧培養(yǎng)后收集細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，上樣80 μg進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，一抗孵育（兔抗人HIF?1α單克隆抗體的濃度為1∶1 000；兔抗人VEGF單克隆抗體的濃度為1∶200，鼠抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體的濃度為1∶1 000），4℃過(guò)夜，二抗孵育（山羊抗兔IgG抗體的工作濃度為1∶500；馬抗小鼠IgG抗體的工作濃度為1∶500）2 h，BCIP/NBT顯色液顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，目的蛋白條帶HIF?1α、VEGF與相應(yīng)的內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白條帶的灰度值比值作為其蛋白表達(dá)的半定量指標(biāo)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示。多個(gè)均數(shù)比較用單因素方差分析（one?way ANOVA）。相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 阿維A對(duì)不同缺氧時(shí)間培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞體外增殖的影響（±s）

表1 阿維A對(duì)不同缺氧時(shí)間培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞體外增殖的影響（±s）

注：n=3。a：與空白對(duì)照組比，P＜0.05；b：與空白對(duì)照組組比，P＞0.05；c：與二甲基亞砜對(duì)照組比，P＜0.05

組別空白對(duì)照組二甲基亞砜對(duì)照組阿維A（mol/L）10-8 10-7 10-6 10-5 12 h吸光度A 1.167±0.009 1.151±0.015b 1.067±0.008ac 0.995±0.023ac 0.930±0.023ac 0.800±0.019ac抑制率（%）-1.61±0.97b 8.57±0.14ac 14.68±2.24ac 20.24±1.42ac 31.43±1.65ac 24 h吸光度A 0.862±0.034 0.853±0.026b 0.747±0.020ac 0.673±0.033ac 0.585±0.009ac 0.541±0.031ac抑制率（%）-1.10±0.95b 13.31±1.15ac 21.86±5.31ac 32.05±2.99ac 37.28±3.21ac 36 h吸光度A 0.550±0.013 0.539±0.021b 0.435±0.019ac 0.377±0.018ac 0.330±0.010ac 0.287±0.017ac抑制率（%）-2.02±1.45b 20.86±4.84ac 31.37±4.20ac 40.02±1.50ac 47.74±2.33ac

結(jié) 果

一、阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞體外增殖的影響

阿維A 10-8、10-7、10-6、10-5mol/L作用于缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞12、24、36 h，對(duì)體外增殖均有不同程度的抑制作用，作用24 h后，HaCaT細(xì)胞體外增殖抑制率分別為（13.31±1.15）%、（21.86±5.31）%、（32.05±2.99）%、（37.28±3.21）%，隨著缺氧培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)和阿維A濃度增加，對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，在10-5mol/L的阿維A作用下，缺氧培養(yǎng)36 h，HaCaT細(xì)胞體外增殖抑制率達(dá)（47.74±2.33）%。見(jiàn)表1。

二、阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞HIF?1α、VEGF mRNA及其蛋白表達(dá)的影響

不同濃度阿維A作用于缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞24 h后，與空白對(duì)照組（缺氧培養(yǎng)0 h）相比，HIF?1α mRNA的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而 HIF?1α 蛋白、VEGF蛋白及其mRNA表達(dá)隨著阿維A濃度的增高表達(dá)量下降，當(dāng)阿維A濃度為10-5mol/L時(shí)，HIF?1α/β肌動(dòng)蛋白 蛋白灰度比由1.196±0.088降至0.319±0.180，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；VEGF mRNA/β肌動(dòng)蛋白 mRNA灰度比由對(duì)照組1.108±0.073下降至0.442±0.090，VEGF/β肌動(dòng)蛋白蛋白灰度比由對(duì)照組1.174±0.186下降至0.216±0.066，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。空白對(duì)照組中不同缺氧培養(yǎng)時(shí)間的HaCaT細(xì)胞，與缺氧培養(yǎng)0 h組相比，HIF?1α mRNA的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HIF?1α蛋白、VEGFmRNA與蛋白在24 h內(nèi)隨著缺氧培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)量上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表2，3，圖1～4。

三、HaCaT細(xì)胞HIF?1α與VEGF表達(dá)量的相關(guān)性分析

不同濃度阿維A處理后，HIF?1α與VEGF蛋白表達(dá)量之間呈正相關(guān)，r=0.838，P＜0.05。

表2 缺氧培養(yǎng)對(duì)HaCaT細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF?1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 缺氧培養(yǎng)對(duì)HaCaT細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF?1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。a：與缺氧0 h組比，P＞0.05；b：與缺氧0 h組比，P＜0.05

缺氧培養(yǎng)時(shí)間0 h 12 h 24 h 36 h HIF?1α mRNA 0.873±0.050 0.857±0.079a 0.819±0.073a 0.840±0.084a蛋白0.453±0.065 0.895±0.061b 1.298±0.227b 0.859±0.132b VEGF mRNA 0.651±0.029 0.836±0.014b 1.080±0.079b 0.780±0.095b蛋白0.458±0.061 0.759±0.142b 1.012±0.114b 0.671±0.041b

表3 阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF?1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

表3 阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF?1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。a：與空白對(duì)照組比，P＞0.05；b：與空白對(duì)照組比，P＜0.05

組別空白對(duì)照組二甲基亞砜對(duì)照組阿維A（mol/L）10-8 10-7 10-6 10-5 HIF?1α mRNA 0.891±0.097 0.887±0.111a 0.912±0.108a 0.875±0.100a 0.911±0.097a 0.917±0.085a蛋白1.196±0.088 1.161±0.120a 0.947±0.128b 0.778±0.086b 0.565±0.067b 0.319±0.180b VEGF mRNA 1.108±0.073 1.128±0.069a 0.891±0.069b 0.738±0.056b 0.596±0.036b 0.442±0.090b蛋白1.174±0.186 1.180±0.138a 0.918±0.080b 0.669±0.073b 0.444±0.144b 0.216±0.066b

圖1 阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）mRNA表達(dá)的影響 1：空白對(duì)照組；2：二甲基亞砜對(duì)照組；3～6：分別為阿維A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L組

圖2 阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）蛋白表達(dá)的影響 1：空白對(duì)照組；2：二甲基亞砜對(duì)照組；3～6：分別為阿維A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L組

圖3 阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA表達(dá)的影響 1：空白對(duì)照組；2：二甲基亞砜對(duì)照組；3～6：分別為阿維A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L組

圖4 阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）蛋白表達(dá)的影響 1：空白對(duì)照組；2：二甲基亞砜對(duì)照組；3～6：分別為阿維A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L組

討 論

阿維A治療銀屑病療效較好。有研究發(fā)現(xiàn)，阿維A治療銀屑病患者后皮損處及血清中的VEGF蛋白水平明顯低于治療前［6］。銀屑病具有特征性的細(xì)胞過(guò)度增殖和局域性缺氧［7］。角化是角質(zhì)形成細(xì)胞終末分化階段，是由腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明，缺氧可通過(guò)激活自噬從而抑制腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體最終抑制細(xì)胞的凋亡［8］。缺氧時(shí)腫瘤細(xì)胞血管生成和轉(zhuǎn)移潛力增強(qiáng)，如細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間黏附能力下降［9］。此外，缺氧還可通過(guò)下調(diào)表皮棘細(xì)胞層的標(biāo)記蛋白K1/K10的水平，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的異常分化［10］。本研究結(jié)果表明，不同濃度阿維A對(duì)缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞體外增殖均有不同程度的抑制作用，隨著缺氧培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)和阿維A濃度增加，對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，在阿維A 10-5mol/L的作用下，缺氧培養(yǎng)36 h，HaCaT細(xì)胞體外增殖抑制率達(dá)（47.74±2.33）%。以往的研究結(jié)果表明，阿維A對(duì)常氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞體外增殖具有抑制作用［11］。本研究用缺氧培養(yǎng)方法與銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞所處病理生理環(huán)境更趨一致，提示阿維A對(duì)缺氧狀態(tài)下的角質(zhì)形成細(xì)胞同樣具有抑制作用。

HIF?1α是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，因其廣泛的靶基因譜在與缺氧適應(yīng)、炎癥發(fā)展及腫瘤生長(zhǎng)等活動(dòng)中發(fā)揮重要作用［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度阿維A處理HaCaT細(xì)胞后HIF?1α mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化，而隨著阿維A濃度的增加，HIF?1α蛋白表達(dá)量逐漸下降，與缺氧0 h組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)阿維A調(diào)節(jié)HIF?1α可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，HIF?1α蛋白表達(dá)下調(diào)可進(jìn)一步促進(jìn)下游與血管生成、細(xì)胞增殖、遷移和炎癥形成相關(guān)的靶基因表達(dá)發(fā)生改變。

VEGF是對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子，能在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生［12］，是HIF?1α重要的靶基因之一［2］。研究表明，VEGF的表達(dá)水平與銀屑病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系［3］。有報(bào)道將編碼VEGF的基因轉(zhuǎn)入小鼠皮膚可致銀屑病樣改變［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，阿維A在抑制缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞HIF?1α蛋白表達(dá)的同時(shí)，對(duì)VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)也有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著阿維A濃度的增加，HIF?1α和VEGFmRNA及蛋白水平的表達(dá)量逐漸下降。已有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)HIF?1α的產(chǎn)生，從而激活A(yù)pelin/APLNR和下游的MAPK信號(hào)通路，最終促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（分化成內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管）的增殖［14］。我們推測(cè)阿維A可以直接或間接下調(diào)HIF?1α的表達(dá)，進(jìn)而使其下游一系列的靶基因如VEGF等的表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)銀屑病皮損的恢復(fù)。

［1］Semenza GL,Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation［J］.Mol Cell Biol,1992,12（12）:5447?5454.

［2］JingSW,WangYD,KurodaM,etal.HIF?1 αcontributes tohypoxia?induced invasion and metastasis of esophageal carcinoma via inhibiting E ?cadherin and promoting MMP ?2［J］.Acta Med Okayama,2012,66（5）:399?407.

［3］Vasilopoulos Y,Sourli F,Zafiriou E,et al.High serum levels of HIF?1α in psoriatic patients correlate with an over?expression of IL ?6［J］.Cytokine,2013,62（1）:38 ?39.DOI:10.1016/j.cyto.2013.02.029.

［4］Tao J,Yang J,Wang L,et al.Expression of GLUT?1 in psoriasis and the relationship between GLUT?1 upregulation induced by hypoxia and proliferation of keratinocyte growth［J］.J Dermatol Sci,2008,51（3）:203?207.DOI:10.1016/j.jdermsci.2008.04.012.

［5］Zouboulis CC.Retinoids?which dermatological indications will benefit in the near future?［J］.Skin Pharmacol Appl Skin Physiol,2001,14（5）:303?315.

［6］溫炬,羅權(quán),張錫寶,等.阿維A治療前后對(duì)銀屑病患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響［J］.中華皮膚科雜志,2005,38（9）:540?542.DOI:10.3760/j.issn:0412?4030.2005.09.003.Wen J,Luo Q,Zhang XB,et al.Effects of acitretin on angiogenesis induced by vascular endothelial growth factor（VEGF）in patients with psoriasis［J］.Chin J Dermatol,2005,38（9）:540?542.DOI:10.3760/j.issn:0412?4030.2005.09.003.

［7］Armstrong AW,Voyles SV,Armstrong EJ,et al.Angiogenesis and oxidative stress:common mechanisms linking psoriasis with atherosclerosis［J］.J Dermatol Sci,2011,63（1）:1 ?9.DOI:10.1016/j.jdermsci.2011.04.007.

［8］Kim SW,Park SY.Hypoxia?mediated activation of autophagic flux inhibits apoptosis of keratinocytes via blocking tumor necrosis factor?related apoptosis?inducing ligand［J］.Mol Med Rep,2016,13（1）:805?810.DOI:10.3892/mmr.2015.4592.

［9］Park JE,Tan HS,Datta A,et al.Hypoxic tumor cell modulates its microenvironment to enhance angiogenic and metastatic potential by secretion of proteins and exosomes［J］.Mol Cell Proteomics,2010,9（6）:1085?1099.DOI:10.1074/mcp.M900381?MCP200.

［10］Park JY,Jung JY,Kim HJ,et al.Hypoxia leads to abnormal epidermal differentiation via HIF ?independent pathways［J］.Biochem Biophys Res Commun,2016,469（2）:251?256.DOI:10.1016/j.bbrc.2015.11.111.

［11］相風(fēng)梅,魏志平,鐘連生,等.阿維A對(duì)HaCaT細(xì)胞體外凋亡和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（7）:494?498.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2014.07.012 Xiang FM,Wei ZP,Zhong LS,et al.In vitroeffects of acitretin on the apoptosis and expressions of insulin?like growth factor binding protein 7 and vascular endothelial growth factor in HaCaT cells［J］.Chin J Dermatol,2014,47（7）:494 ?498.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2014.07.012.

［12］Ferrara N.Binding to the extracellular matrix and proteolytic processing:two key mechanisms regulating vascular endothelial growth factor action［J］.Mol Biol Cell,2010,21（5）:687?690.DOI:10.1091/mbc.E09?07?0590.

［13］Xia YP,Li B,Hylton D,et al.Transgenic delivery of VEGF to mouse skin leads to an inflammatory condition resembling human psoriasis［J］.Blood,2003,102（1）:161?168.DOI:10.1182/blood?2002?12?3793.

［14］Zhang J,Liu Q,Fang Z,et al.Hypoxia induces the proliferation of endothelial progenitor cells via upregulation of Apelin/APLNR/MAPK signaling［J］.Mol Med Rep,2016,13（2）:1801 ?1806.DOI:10.3892/mmr.2015.4691.

Effects of acitretin onin vitroproliferation of HaCaT cells cultured in hypoxic condition and on expressions of hypoxia?inducible factor?1α and vascular endothelial growth factor

Wang Huanling,Wei Zhiping,Guo Wu,Hou Xiaoyang,Liu Yanqun
Department of Dermatology,The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu,China

ObjectiveTo evaluate effects of acitretin on HaCaT cells cultured in hypoxic condition,and to preliminarily explore the possible therapeutic mechanisms of acitretin in psoriasis.MethodsHaCaT cells were divided into several groups to be cultured in hypoxic condition with the presence of acitretin at concentrations of 10-5,10-6,10-7and 10-8mol/L respectively,with cells treated with dimethyl sulfoxide（DMSO）as DMSO control group and those receiving no treatment as blank control group.Cellular proliferative activity was evaluated by CCK?8 assay after 12?,24?and 36?hour hypoxic culturein vitro.The mRNA and protein expressions of hypoxia?inducible factor?1α（HIF?1α）and vascular endothelial growth factor（VEGF）were determined by reverse transcription（RT）?PCR and Western?blot analysis,respectively,after 24?hour hypoxic culture.ResultsAfter 24?hour hypoxic culture,the cellular proliferation rate was inhibited by 13.31%±1.15%,21.86%±5.31%,32.05%±2.99%and 37.28%±3.21%in the 10-8?,10-7?,10-6?and 10-5?mol/L acitretin groups respectively.With the increase of culture duration and acitretin concentrations,the degree of inhibition on cellular proliferation increased gradually.Compared with the blank control group,the 10-5?mol/L acitretin group showed significantly decreased protein expression of HIF?1α（0.319±0.180vs.1.196±0.088,P＜0.05）,as well as decreased mRNA and protein expressions of VEGF（mRNA:0.442± 0.090vs.1.108±0.073;protein:0.216±0.066vs.1.174±0.186;bothP＜0.05）.However,no significant difference was found in the mRNA expression of HIF?1α between the 10-5?mol/L acitretin group and blank control group.ConclusionAcitretin can suppress thein vitroproliferation of HaCaT cells cultured in hypoxic condition,and down?regulate the expressions of HIF?1α and VEGF proteins as well as VEGF mRNA.

Acitretin;Anoxia;Hypoxia?inducible factor 1,alpha subunit;Endothelial growth factors;Cell proliferation;HaCaT cells

Wei Zhiping,Email:xzwzp1961@aliyun.com

2016?01?05）

（本文編輯：吳曉初）

魏志平，Email：xzwzp1961@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.09.003