篩選浙貝母內(nèi)生真菌以及抑菌活性菌株性質(zhì)研究

摘 要：目的：對(duì)浙貝母內(nèi)生真菌以及抑菌活性菌株性質(zhì)進(jìn)行分析探討，為今后的研究工作提供可靠的理論依據(jù)。方法：采取組織分離印跡對(duì)照法自浙貝母植株中分離內(nèi)生真菌，經(jīng)牛津杯法對(duì)抑菌活性進(jìn)行篩選，對(duì)活性菌株展開(kāi)發(fā)酵培養(yǎng)，并繪制出抑菌活性變化曲線(xiàn)、培養(yǎng)基消耗曲線(xiàn)以及次生代謝產(chǎn)物濃度變化曲線(xiàn)，經(jīng)高效發(fā)酵體系對(duì)抑菌活性菌株進(jìn)行發(fā)酵，分離濃縮發(fā)酵液后，進(jìn)行萃取分離。結(jié)果：經(jīng)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)中共獲得36種內(nèi)生真菌，低下鱗莖中分離的BJ7具有很高的抑菌活性；發(fā)酵9天時(shí)的BJ7抑菌活性最佳。結(jié)論：浙貝母中可分離得到多種內(nèi)生真菌，其中以BJ7的抑菌活性最高，應(yīng)對(duì)其給予重視。

關(guān)鍵詞：浙貝母；內(nèi)生真菌；抑菌活性；菌株性質(zhì)；分離純化

本次研究中出于對(duì)浙貝母內(nèi)生真菌以及抑菌活性菌株性質(zhì)進(jìn)行分析探討的目的，采取多種分離、純化、培養(yǎng)手段對(duì)浙貝母中內(nèi)生真菌以及抑菌活性菌株進(jìn)行了分離研究，現(xiàn)匯報(bào)結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)藥物：寧波鄞州所產(chǎn)浙貝母，在花期采集地上和低下兩部分，清洗干凈后保存在4℃的環(huán)境中。

培養(yǎng)基：浙貝母內(nèi)生真菌分離與純化的培養(yǎng)基選擇PDA培養(yǎng)基[1]，組成包括：土豆?jié)舛葹?00g/l，葡萄糖濃度為20g/l，瓊脂濃度為20g/l；采取LB培養(yǎng)基作為細(xì)菌類(lèi)的指示菌[2]，組成包括：酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，氯化鈉5g/l，pH7.4；真菌發(fā)酵采取查氏優(yōu)化液培養(yǎng)基[3]，組成包括：蛋白胨0.5%，KCL0.05%，葡萄糖8%，K2HPO40.1%，MgSO40.15%，pH6.5。

指示菌：試驗(yàn)中指示菌選擇金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化

取新鮮、無(wú)蟲(chóng)害的浙貝母，分葉、莖、地下鱗莖等三個(gè)組成部分，采用濃度為75%的酒精浸泡1min左右之后，經(jīng)無(wú)菌水進(jìn)行反復(fù)沖洗，沖洗次數(shù)控制在3-4次之間，在采用濃度為0.1%的升汞中浸泡5min左右，再采用無(wú)菌水進(jìn)行反復(fù)沖洗，沖洗次數(shù)控制3-4次之間，經(jīng)解剖刀將外植體切塊，大小控制在5mm×5mm，接種到PDA培養(yǎng)基中，防止在28℃的培養(yǎng)箱中，并保證避光培養(yǎng)3-5天，然后待邊緣長(zhǎng)出菌絲，挑取邊緣生長(zhǎng)狀況良好的單一菌絲，接種在新配置PDA培養(yǎng)基中，長(zhǎng)成菌落后再挑取邊緣菌絲培養(yǎng)，如此反復(fù)進(jìn)行菌株純化處理，觀(guān)察菌落的具體生長(zhǎng)情況。分離純化操作結(jié)束之后，重復(fù)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)操作，采取同樣的方法實(shí)施再次的分離純化處理，最后將分離后得到的真菌與第一次分離處理后得到的真菌進(jìn)行對(duì)比觀(guān)察，對(duì)真菌的內(nèi)生以及來(lái)源進(jìn)行確定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該設(shè)置空白平板作為對(duì)照觀(guān)察。

1.2.2 抑菌活性的測(cè)定

將研究所需要的菌株接種到新鮮PDA平板上，在28℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)一個(gè)星期左右，當(dāng)真菌已經(jīng)長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)平板的時(shí)候，可以經(jīng)試管口在平板上壓出一個(gè)大小一致的PDA培養(yǎng)基圓餅，取出后放置在涂有三種細(xì)菌液的LB培養(yǎng)基，在28℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)一天的時(shí)間，仔細(xì)觀(guān)察對(duì)圓餅周?chē)欠裼幸志Τ霈F(xiàn)，將無(wú)菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照觀(guān)察。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生真菌的菌落特征

新鮮浙貝母經(jīng)分離處理后得到36種真菌，葉中分離處理后得到14種真菌，占38.89%，自莖中分離得到9種，占25.00%，地下鱗莖中分離處理后得到13種真菌，占36.11%。

2.2 活性菌株的篩選與鑒定

低下鱗莖分離處理后得到BJ菌株，對(duì)臨床上常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均具有非常明顯的抑菌作用。菌株正面呈絨毛狀，黃綠色，邊緣呈纖毛狀，培養(yǎng)基腹面能夠觀(guān)察到棕黃色菌株，鏡下孢子梗呈長(zhǎng)鏈狀，有特有形態(tài)。將內(nèi)生真菌菌絲提取的基因組作為模板，經(jīng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)施電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)單一明亮，片段在750bp左右，與預(yù)期的大小基本一致，試驗(yàn)中將基因序列與NCBI基因庫(kù)進(jìn)行了對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與曲霉屬Aspergillus sp.的相似度為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析證實(shí)活性菌株為Aspergillus sp.BJ7。

2.3 Aspergillus sp.BJ7性質(zhì)初步研究結(jié)果

經(jīng)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液自滴5天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的抑菌效果，在第9天時(shí)得到峰值，培養(yǎng)基在2-7天時(shí)開(kāi)始快速降低，在第8-12天時(shí)保持平穩(wěn)，證實(shí)Aspergillus sp.BJ7在第8天后基本停止生長(zhǎng)繁殖。通過(guò)觀(guān)察組第1-12天的發(fā)酵液吸光值發(fā)現(xiàn)，Aspergillus sp.BJ7的次生代謝產(chǎn)物濃度在第5天時(shí)達(dá)到峰值，在第8-9天時(shí)達(dá)到最低值，且保持平穩(wěn)，發(fā)酵液在60被稀釋后失去了抑菌活性，由此可推斷，Aspergillus sp.BJ7在第2-7天之間屬于快速生長(zhǎng)期，從第8天開(kāi)始會(huì)有次生代謝產(chǎn)物大量出現(xiàn)，抑菌效果從第10天開(kāi)始呈現(xiàn)逐漸的降低的發(fā)展趨勢(shì)。

3 討論

臨床上應(yīng)用的中藥材浙貝母為百合科貝母屬多年生草本植物的一種，生物堿是其主要有效成分，貝母素甲和貝母素乙是最為常見(jiàn)的兩種，屬于異甾體生物堿類(lèi)物質(zhì)的一種。浙貝母的主要功效作用為止咳、清熱化痰、開(kāi)郁散結(jié)，臨床主要應(yīng)用該藥物對(duì)上呼吸道感染、胃十二指腸潰瘍、咽喉腫痛、支氣管炎、甲狀腺腫大、肺熱咳嗽、乳腺炎等疾病進(jìn)行治療，效果非常理想[4]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，浙貝母中可分離多種內(nèi)生真菌[5]。由本次試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，真菌在浙貝母植株中的分布以葉和地下鱗莖為主，其次為莖中。試驗(yàn)中觀(guān)察到，發(fā)酵液抑菌活性從第9天開(kāi)始呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)，主要由于抑菌活性物質(zhì)屬于堿性類(lèi)物質(zhì)，Aspergillus sp.BJ7在生長(zhǎng)后期會(huì)有酸性物質(zhì)大量分泌，兩者發(fā)生中和反應(yīng)，或?qū)σ志钚晕镔|(zhì)造成嚴(yán)重的破壞，也可能是抑菌活性物質(zhì)在Aspergillus sp.BJ7生長(zhǎng)后期被分解利用，進(jìn)而引起發(fā)酵抑菌活性逐漸降低[6]。

綜上所述，浙貝母中內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物可以對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、格蘭陰性菌產(chǎn)生較為普遍的抑菌作用，證實(shí)浙貝母中內(nèi)生真菌存在廣泛的抑菌活性物質(zhì)，經(jīng)分離純化與鑒定發(fā)現(xiàn)，其主要抑菌活性菌株為Aspergillus sp.BJ7，值得人們對(duì)其給予足夠的重視。

參考文獻(xiàn)

[1]田峰，何仁發(fā)，李明月，等.浙貝母內(nèi)生真菌菌珠FTJZZJ09及其抑菌活性成分[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（10）：93.

[2]葉波平，張少華，劉冰，等.浙貝母內(nèi)生真菌Nectria sp.JZ6分泌抑菌活性代謝產(chǎn)物的初步研究[J].菌物學(xué)報(bào)，2009，28（04）：603.

[3]顏霞，李希堯，李偉國(guó).喜樹(shù)內(nèi)生真菌的分離及其代謝產(chǎn)物的初步研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（03）：315.

[4]董慶霖，陳博，邢向英，等.一株藍(lán)藻內(nèi)生真菌的鑒定及其產(chǎn)物抑菌活性[J].化工學(xué)報(bào)，2011，14（06）：1023-1024.

[5]祝興偉，張少華，王治維，等.一株來(lái)自于伊犁貝母的內(nèi)生尖孢鐮孢菌Y1的抑菌活性初步研究[J].菌物學(xué)報(bào)，2009，15（03）：332-334.

[6]王艷紅，徐磊，楊信東，等.溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的分離及其抗菌活性的初步研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2009，16（13）：213-215.

作者簡(jiǎn)介：陳弘毅（1984，8-），男，籍貫：浙江上虞，研究方向：藥物菌體篩選發(fā)酵提取及研制研究。