加壓素細(xì)菌內(nèi)毒素分析方法學(xué)

摘 要：目的：建立加壓素細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法。方法：采用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑，以凝膠法定性測(cè)定xxx的細(xì)菌內(nèi)毒素水平，通過(guò)干擾初篩試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證；結(jié)論：凝膠法適用于xxx的內(nèi)毒素定性檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌內(nèi)毒素；凝膠法；多肽

實(shí)驗(yàn)材料

樣品（s）：加壓素內(nèi)毒素限制2.5EU/mg。

鱟試劑：湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品

批號(hào)：1209121 靈敏度：0.25EU/ml 規(guī)格：0.1ml/支

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（W）：湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品

批號(hào)：1209230 規(guī)格：5ml/支

細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（NSE）：中國(guó)藥品生物制品鑒定所

批號(hào)：150601-201176 效價(jià)：100EU/支

孵育反應(yīng)儀器：湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品 TAL-40型試管恒溫儀

無(wú)熱源空安瓿：湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品 規(guī)格：5ml/支

無(wú)熱源吸頭：湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品 規(guī)格：200ul/支、1000ul/支

移液器：DragonLAB 100～1000ul、20～200ul

天平：梅特勒 型號(hào)：MS105DU 精度：十萬(wàn)分之一

其他：漩渦混合器、安瓿小護(hù)士、封口膜

1 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.1 樣品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的計(jì)算：10mg樣品溶劑于10ml內(nèi)毒素檢查用水中，L為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度值2.5EU/mg；λ為所選鱟試劑的靈敏度。

MVD=CL/λ =1×2.5/0.25=10倍

靈敏度0.25、0.125、0.06、0.03 EU/ml對(duì)應(yīng)的MVD為10、20、40、80。

1.2 干擾初篩試驗(yàn)：選擇0.25EU/ml鱟試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（C）的制備：將NSE稀釋到4λ=1EU/ml、2λ=0.5EU/ml濃度溶液，記為E1、E0.5，備用。

1.2.2 供試品溶液（A）的制備

10mgS+10mlW→10.0mlS

0.5mlS+2.0mlW→2.5mlS0

1.0mlS0+1.0mlW→2.0mlS1

1.0mlS1+1.0mlW→2.0mlS2

1.0mlS2+1.0mlW→2.0mlS4

1.0mlS4+1.0mlW→2.0mlS8

1.0mlS8+1.0mlW→2.0mlS16

1.2.3 內(nèi)毒素供試品溶液（B）的制備

0.5mlS1+0.5mlE1→1.0mlS2E0.5

0.5mlS2+0.5mlE1→1.0mlS4E0.5

0.5mlS4+0.5mlE1→1.0mlS8E0.5

0.5mlS8+0.5mlE1→1.0mlS16E0.5

1.2.4 結(jié)果：取鱟試劑分別與A、B及C溶液反應(yīng)。另2支（D）加入0.1ml檢查用水。

結(jié)果：樣品、陰性對(duì)照為陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，故試驗(yàn)有效，且第一個(gè)樣品陽(yáng)性結(jié)果的濃度即可初步般定位樣品的無(wú)干擾濃度。

1.3 干擾驗(yàn)證試驗(yàn)：選用0.25EU/ml鱟試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

1.3.1 內(nèi)毒素溶液（C）制備：同1.2.1項(xiàng)下方法制備。

1.3.2 內(nèi)毒素供試品（B）制備：取三批樣品分別按下法制備

0.5mlS1+0.5mlE1→1.0mlS2E0.5

0.5mlS1+0.5mlE0.5→1.0mlS2E0.25

0.5mlS1+0.5mlE0.25→1.0mlS2E0.125

0.5mlS1+0.5mlE0.125→1.0mlS2E0.06

1.3.3 取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑36支，各加入0.1ml內(nèi)毒素檢查用水。

1.3.4 加樣

將準(zhǔn)備好的鱟試劑取其中18支（管）放在安瓿架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對(duì)照。將另外18支（管）鱟試劑，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素供試品溶液，另1列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對(duì)照。

1.3.5 結(jié)果

表2 干擾驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

計(jì)算公式：Es=antilg（ΣXs/4） Et=antilg（ΣXt/4）

20121201 Es=antilg[（lg0.25）×4]/4=0.25EU/ml

Et=antilg[（lg0.25）×3+（lg0.125）]/4=0.21EU/ml

20121202 Es=antilg[（lg0.25）×4]/4=0.25EU/ml

Et=antilg[（lg0.25）×4]/4=0.25EU/ml

20121203 Es=antilg[（lg0.25）×4]/4=0.25EU/ml

Et=antilg[（lg0.25）×3+（lg0.125）]/4=0.21EU/ml

2結(jié)束語(yǔ)

3批樣品兩組最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ均為陰性，陰性對(duì)照4管均為陰性，Es在0.5λ～2λ之間，且0.5Es2.0Es，供試品在該濃度下不干擾試驗(yàn)，可在該濃度下對(duì)此供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。