慢性氟中毒誘發(fā)大鼠腎臟損傷機(jī)制的研究

摘要：目的 探討慢性氟化鈉中毒大鼠腎臟損傷的作用機(jī)理。方法 通過給大鼠自由飲用含有不同劑量氟化鈉煮沸冷卻自來水4個(gè)月，制備慢性氟中毒模型，測定其血清中尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平，同時(shí)檢測各組大鼠腎臟總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽（GSH）的活力含量。結(jié)果 氟化鈉慢性中毒各組尿氟和血氟含量均比正常對(duì)照組增高（P<0.01），并且中、高劑量組大鼠血清BUN、Cr活性增高（P<0.01）；氟化鈉各劑量組大鼠腎臟MDA含量均顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），S0D和T-AOC活性顯著下降（P<0.01），同樣中、高劑量組GSH含量活性顯著下降（P<0.01）。結(jié)論 自由基水平增高誘發(fā)脂質(zhì)過氧化可能是氟致大鼠腎臟損傷的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：氟化鈉；慢性氟中毒；腎臟；自由基；脂質(zhì)過氧化；大鼠

長期以來，氟中毒主要損害牙齒、骨骼等骨性組織已十分明確，而對(duì)內(nèi)臟的損害卻未能引起起臨床學(xué)和病理學(xué)醫(yī)生的重視。氟是機(jī)體重要的微量元素之一，但攝入過量能引起廣泛的全身性病變，其作用機(jī)理至今尚不清楚。近年來，氟中毒引起的非骨相損害越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，慢性氟中毒是嚴(yán)重危害人類健康的全身性疾病，腎臟是氟排除的主要器官，也是氟中毒的靶器官之一，但氟中毒的病理機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚無一致的解釋。有研究報(bào)道，氟中毒的病理機(jī)制可能與其在機(jī)體造成自由基堆積、氧化損傷增強(qiáng)，抗氧化酶活性降低有關(guān)[1，2]。機(jī)體慢性氟中毒時(shí)內(nèi)臟組織病理損傷可能與氟誘導(dǎo)機(jī)體脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)有關(guān)[3]，但脂質(zhì)過氧化在氟中毒腎臟損傷中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過制備大鼠氟化鈉慢性中毒模型，檢測氟中毒大鼠血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平，并觀察腎臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽（GSH）含量的變化，進(jìn)一步探討腎臟損傷與脂質(zhì)過氧化或者自由基之間的關(guān)系，為深入研究氟中毒腎臟病變提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重（100±10）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYKG桂2003-0005。動(dòng)物室溫度：（25±2）℃，相對(duì)濕度：（60±5）%。動(dòng)物以廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制的飼養(yǎng)。

1.2主要藥品和試劑 氟化鈉（北京化工廠生產(chǎn)，批號(hào)：070703）；尿素氮測定試劑盒（批號(hào)：20091114），肌酐測定試劑盒（批號(hào)：20091114），均為長春匯力生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；總抗氧化能力測定試劑盒（批號(hào)：20090918），丙二醛測定試劑盒（批號(hào)：20090918），超氧化物歧化酶測定試劑盒（批號(hào)：20090905），谷胱甘肽測定試劑盒（批號(hào)：20090905），考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（批號(hào)：20050723）測定，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.3主要儀器 電熱恒溫水?。ū本╅L安科學(xué)儀器廠）；低溫高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；日本東芝TBA-120FR生化分析儀（日本東芝公司產(chǎn)）；722S分光光度計(jì)（北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；漩渦混合器XW-80A（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠）。

1.4動(dòng)物分組 健康Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為四組，每組15只，分別分為空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組電針治療組。其中低、中、高劑量組大鼠分別自由飲用有含氟化鈉55、110、222mg/L的煮沸冷卻自來水，空白對(duì)照組大鼠自由飲用煮沸冷卻自來水。給藥期間稱體重1次/2w，并觀察一般狀況，有無死亡等情況，實(shí)驗(yàn)周期共4個(gè)月。

1.5指標(biāo)觀察與測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后前1d收集大鼠24h的尿液，以待測定尿氟含量；各組大鼠采用摘除眼球取血，靜置后3000r/min離心15min分離血清，采用采用氟離子選擇電極法測定尿氟、血氟含量，采用生化分析儀檢測BUN、Cr。頸椎脫臼處死大鼠，取腎臟剪碎后加入9倍生理鹽水在冰浴中制成10%（W/V）腎臟勻漿組織液，3000r/min離心15min分離上清液，于-20℃保存待測；分別采用分光光度法組織中T-AOC活力、硫代巴比妥酸染色法測定MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性和二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH含量，均采用南京建成生物工程研究所產(chǎn)品試劑盒，具體操作步驟嚴(yán)格按照均按照說明書操作測定。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)計(jì)量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均在計(jì)算機(jī)中由SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1一般狀況 空白對(duì)照組和低劑量組大鼠活動(dòng)正常，體重增長正常，毛色光澤；而中、高劑量組大鼠安靜少動(dòng)、體重體重增長率隨染毒劑量增加呈降低趨勢，飲水量偏多，部分大鼠毛色無光澤?？瞻讓?duì)照組大鼠門牙呈棕黃色，表面色澤光滑；中、高劑量組所有大鼠門齒均發(fā)生了氟斑牙，表面粗糙，光澤偏黃色，重者甚至發(fā)生牙齒缺損。實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組雌性大鼠死亡1只；中劑量組雄性大鼠死亡2只；高劑量組雄性大鼠死亡3只，雌性大鼠死亡1只。

2.2氟化鈉慢性中毒大鼠尿氟、血氟含量變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)月后氟化鈉各劑量組大鼠尿氟、血氟含量顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），表明氟化鈉慢性中毒模型建立成功。而且隨著染氟劑量增加，尿氟和血氟含量也增高，具有劑量-反應(yīng)關(guān)系，見表1。

2.3氟化鈉慢性中毒大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，氟化鈉中、高劑量組大鼠BUN、Cr濃度水平顯著升高（P<0.01），表明慢性中毒過程中氟化鈉誘發(fā)大鼠肝臟損傷，見表2。

2.4氟化鈉慢性中毒大鼠腎臟脂質(zhì)過氧化的改變 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予氟化鈉3個(gè)月后，氟化鈉各個(gè)劑量組大鼠肝臟中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA具有顯著性增高（P<0.05、P<0.01），且與劑量的增加呈現(xiàn)一定的正比關(guān)系；而SOD和T-AOC隨著氟化鈉劑量的增加而顯著性降低（P<0.05、P<0.01），表明機(jī)體抗氧化能力作用減弱。同樣中、高劑量組GSH含量活性顯著下降（P<0.01，P<0.05），見表3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的含氟水喂飼大鼠4個(gè)月后，氟化鈉各劑量組大鼠尿氟、血氟含量均顯著高于正常對(duì)照組，表明已成功地復(fù)制出了氟中毒大鼠模型。腎臟在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的功能。由于肝臟和腎臟特別是腎臟是動(dòng)物和人體氟排泄的主要器官，也是氟中毒的重要靶器官之一[4]。血清BUN和Cr濃度在一定程度上可反映腎小球?yàn)V過率功能的損害程度，是常用的腎功能指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過4個(gè)月的喂養(yǎng)后，各組大鼠血清BUN和Cr濃度升高（P<0.01），說明氟化鈉各劑量組大鼠腎功能均受到損傷。

慢性氟中毒是一種全身性疾病，可導(dǎo)致氟在體內(nèi)蓄積，引起氟中毒，過量氟進(jìn)入機(jī)體除了累及牙齒和骨組織外，對(duì)非骨相組織和器官亦能產(chǎn)生損害作用[2]。地氟病發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明清楚，自由基代謝紊亂引起的氧化應(yīng)激性損傷在地氟病的研究中一直是個(gè)熱點(diǎn)，發(fā)病機(jī)制仍很不清楚。近年來，自由基在疾病發(fā)生中的作用越來越多地受到重視。研究發(fā)現(xiàn)慢性氟中毒與自由基損傷密切相關(guān)，提出自由基損傷是慢性氟中毒發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)[5-7]。 氟作為一種化學(xué)性質(zhì)極活潑的元素，在體內(nèi)外均可形成自由基，或者可通過過量的氟干擾機(jī)體的正?？寡趸瘷C(jī)制，產(chǎn)生過多的氧自由基而損傷膜系統(tǒng)，造成脂質(zhì)過氧化物的增多和清除自由基的酶活性降低[8]。在正常情況下，體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，一旦氧自由基產(chǎn)生過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障，體內(nèi)氧自由基代謝就會(huì)出現(xiàn)失衡，或稱氧化應(yīng)激[9]?；钚匝踝杂苫梢耘c機(jī)體內(nèi)多種生物分子發(fā)生反應(yīng)，破壞正常組織的結(jié)構(gòu)和功能，造成組織細(xì)胞生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等損傷。

由于脂質(zhì)過氧化可造成組織細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，故機(jī)體內(nèi)存在很強(qiáng)的抗氧化系統(tǒng)，包括GSH和VitE等非酶性抗氧化物質(zhì)及SOD和GSH-Px等抗氧化酶系兩部分，外源性毒物可以通過抑制體內(nèi)抗氧化酶系活性或消耗抗氧化物質(zhì)而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)[10]。體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)能力的降低是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的前提，過氧化肝損傷時(shí)機(jī)體組織不僅MDA含量可增高，還導(dǎo)致SOD活力下降和GSH含量降低引。MDA是體內(nèi)自由基攻擊脂質(zhì)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物的代謝最終產(chǎn)物，并可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生進(jìn)一步破壞作用，MDA不僅是反映脂質(zhì)過氧化的敏感指標(biāo)，還可間接反映出細(xì)胞損傷的程度。而SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力。因此，MDA的測定常常與SOD相互配合分析機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化代謝情況。GSH在谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的催化下接受大量電子氧化成二硫化谷胱甘肽（GSSG）的同時(shí)減少了過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物的形成，因此，GSH可作為評(píng)價(jià)氧自由基脂質(zhì)過氧化損傷的較敏感的指標(biāo)[11]。本實(shí)驗(yàn)觀察到慢性氟中毒太鼠腎臟MDA含量增高、SOD活性降低，血清尿素氨含量明顯高于正常對(duì)照組，表明腎功能損傷，提示腎功能損傷與SOD活性降低，MDA含量增多有關(guān)，提示慢性氟中毒時(shí)腎臟損傷與自由基有密切關(guān)系，這也和文獻(xiàn)報(bào)道的相一致[12，13]。此外，實(shí)驗(yàn)中還觀察到GSH和T-AOC含量顯著性降低（P<0.01），提示慢性氟中毒時(shí)機(jī)體抗氧化能力降低，脂質(zhì)過氧化物的生成。高勤等[7]采用ESR法直接檢測慢性氟中毒大鼠腎組織內(nèi)自由基含量的變化，證實(shí)了氟中毒時(shí)腎組織內(nèi)自由基增多的事實(shí)。

上述事實(shí)表明，腎臟的損傷與其中的氟含量有密切的關(guān)系。過多的自由基，攻擊細(xì)胞生物膜，引起脂質(zhì)過氧化過程加強(qiáng)，造成腎臟細(xì)胞損傷。再次論證，氟中毒時(shí)自由基增多誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致腎臟組織損傷的主要機(jī)制之一。本研究結(jié)果為預(yù)防和治療地氟病患者提供了科學(xué)依據(jù)，但其確切機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]郭曉英，孫貴范，孫憲民，等.氧化應(yīng)激在亞慢性氟中毒大鼠肝臟損傷中的作用[J].中國公共衛(wèi)生，2003，19（5）：575-576.

[2]郭曉英，陳愛莉，孫責(zé)范.氟對(duì)大鼠肝臟氧化應(yīng)激及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，34（4）：321-322.

[3]劉戎，魏鳳輝，宣照林.自由基與氟中毒[J].中國地方病防治雜志，2003，18（6）：353-355.

[4]于琳華，張富軍，張?jiān)鲨F，等.過量氟對(duì)大鼠腎肝心損害的形態(tài)學(xué)研究[J].中國地方病學(xué)雜志，2001，20（2）：104-106.

[5]徐輝，張秀云，張桂珍，等.氟中毒大鼠腦組織自由基的變化[J].中國地方病防治雜志，2000，15（6）：324-325.

[6]井玲，邵宗俊，任立群，等.氟中毒大鼠肝細(xì)胞凋亡研究[J].中國地方病學(xué)雜志，2000，18（2）：84-86.

[7]高勤，王守立，于燕妮，等.自由基在慢性氟中毒大鼠腎臟損傷中的作用[J].中國地方病學(xué)雜志，2001，20（2）：94-97.

[8]張傳強(qiáng)，哈斯蘇榮，關(guān)紅，等.五種抗氟中草藥復(fù)方的藥效比較研究[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)， 2007，24（2）：14-17.

[9]孫玉富.自由基與氧化應(yīng)激及其在地方性氟中毒發(fā)病中的作用[J].中國地方病防治雜志，2003，18（1）：37-40.

[10]高勤，王守立，于燕妮，等.慢性氟中毒大鼠腎臟自由基含量與形態(tài)學(xué)變化[J].貴州醫(yī)藥，2005，29（3）：213-215.

[11]宋玉果，王滌.谷胱甘肽作為脂質(zhì)過氧化損傷指標(biāo)的研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1999，33（5）：317-319.

[12]梁剛，孫貴范，李影奕，等.氟對(duì)大鼠脂質(zhì)過氧化和抗氧化能力的影響[J].中國地方病學(xué)雜志，2001，20（2）：109-110.

[13]陳楊，于燕妮，呂學(xué)霞，等.氧化應(yīng)激在燃煤污染型氟中毒大鼠中的作用[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2008，3（4）：1-3.

編輯/哈濤