三維調(diào)控光纖激光引導(dǎo)PC12細(xì)胞突起定向生長

摘要：目的 本實(shí)驗(yàn)采用創(chuàng)新設(shè)計(jì)的光纖激光束引導(dǎo)裝置，精確引導(dǎo)單個(gè)PC12細(xì)胞突起的定向生長，探求光纖引導(dǎo)低能量激光精確控制神經(jīng)細(xì)胞突起在體外定向生長的新方法。方法 選取體外培養(yǎng)突起生長活躍的PC12細(xì)胞為研究對象，將光纖末端經(jīng)拉制后固定于三維微操上。波長為800nm的激光束經(jīng)光纖引導(dǎo)投射在靶區(qū)域，引導(dǎo)過程中光纖隨突起的生長而移動(dòng)，始終與突起的生長方向保持近似垂直位。每隔5min拍攝一張照片，連續(xù)觀察30min。結(jié)果 30例突起生長活躍的PC12細(xì)胞中，20例細(xì)胞突起的生長方向可在5min內(nèi)被波長為800nm的激光影響。在30min的照射中，13例PC12細(xì)胞的突起跟隨光纖激光束生長，偏轉(zhuǎn)角度在60°及以上的有6例，最大偏轉(zhuǎn)角度可達(dá)100°以上。結(jié)論 本引導(dǎo)裝置可影響PC12細(xì)胞突起的生長方向，引導(dǎo)其細(xì)胞突起跟隨激光生長，為光纖引導(dǎo)低能量激光精確控制神經(jīng)細(xì)胞突起在體外定向生長的提供了一種新方法。

關(guān)鍵詞：醫(yī)學(xué)光學(xué)；光纖；激光；PC12細(xì)胞；生長錐

神經(jīng)再生修復(fù)過程中，再生神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)重建關(guān)系到神經(jīng)功能的再生。神經(jīng)元突起定向生長沿一定路徑最后到達(dá)靶位，并與下一個(gè)神經(jīng)元形成正確的突觸連接過程主要依賴于神經(jīng)纖維最前端生長錐的活動(dòng)。生長錐的活動(dòng)受一系列微環(huán)境信號的調(diào)控，局部微環(huán)境的各種化學(xué)或電信號等改變是引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞定向生長的主要體內(nèi)因素。在體外培養(yǎng)條件下，突起沿著黏附性最佳的表面前進(jìn)的特性決定了神經(jīng)元的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[1]，如體外培養(yǎng)的Neuroblastoma-glioma細(xì)胞突起可以沿培養(yǎng)皿表面劃痕或沿血漿凝塊張力線定向生長。電場對軸突亦具有引導(dǎo)作用，Patel等的實(shí)驗(yàn)顯示電壓梯度廣泛存在于發(fā)育中的胚胎，并影響著胚胎中軸突的生長[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，激光作為一種非接觸性的操控方式，也能引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞生長錐的生長方向。A Ehrlicher等學(xué)者采用倒置激光共聚焦顯微鏡對生長中的神經(jīng)元軸突進(jìn)行掃描，引導(dǎo)生長錐的生長[3]。該系統(tǒng)由激光器發(fā)射激光后經(jīng)光路耦合，在倒置激光共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)中央形成激光陷阱，通過操縱激光陷阱位置成功引導(dǎo)生長錐的生長方向[4]。朱天淳等學(xué)者采用倒置式激光陷阱置于PC12細(xì)胞的生長錐前方來引導(dǎo)生長錐的生長方向，通過對生長錐施以持續(xù)作用力，成功引導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞生長錐的生長方向，引導(dǎo)成功率達(dá)65%[5]。然而傳統(tǒng)激光陷阱具有體積大、工作距離短，不宜實(shí)現(xiàn)多光鑷耦合等缺點(diǎn)，使其更廣泛的應(yīng)用受到限制。而光纖技術(shù)克服了上述缺點(diǎn)，以其簡單的結(jié)構(gòu)，低廉的價(jià)格，光全反射的特性，微/納米尺度的操控能力等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到研究者們的廣泛重視。

本研究擬采用創(chuàng)新設(shè)計(jì)的光纖激光束引導(dǎo)裝置，通過調(diào)控三維微操將直徑為納米級的光纖末端定位于生長錐一側(cè)，精確引導(dǎo)PC12細(xì)胞單個(gè)突起的生長，為光纖引導(dǎo)低能量激光精確控制神經(jīng)細(xì)胞突起在體外定向生長尋求新方法并提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1試劑與溶液 L -多聚賴氨酸、胰蛋白酶、谷氨酰胺；高糖DMEM，青霉素-鏈霉素；馬血清，胎牛血清；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。所用溶液包括PBS 0.25%胰蛋白酶，PC12細(xì)胞培養(yǎng)液。PC12細(xì)胞分化培養(yǎng)液。谷氨酰胺在使用前加入到培養(yǎng)基，終濃度為2mM。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞株以含10%馬血清，5%胎牛血清的PC12細(xì)胞培養(yǎng)液維持生長，細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待單層培養(yǎng)細(xì)胞生長至80%匯合后，0.25% 胰蛋白酶消化，以2×104個(gè)/cm2的密度接種于L-多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)皿，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。并用PC12細(xì)胞分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)細(xì)胞分化和突起的生長。在倒置相差顯微鏡下定時(shí)觀察，記錄細(xì)胞貼壁以及神經(jīng)細(xì)胞突起的生長情況。

1.3激光引導(dǎo) 光纖激光束引導(dǎo)裝置：本實(shí)驗(yàn)自行設(shè)計(jì)組裝的光纖激光束引導(dǎo)裝置主要由紅外激光發(fā)射器、光纖、三維微操系統(tǒng)，以及包括對可見光和紅外線敏感的電子成像設(shè)備組成（圖1）。激光發(fā)射器參數(shù)：全固態(tài)半導(dǎo)體激光器，波長 808nm，功率500mw。光纖參數(shù)：陶瓷插芯光纖跳線，型號FC/PC-FC/PC-2～3.0mm-MM-3M，光纖代碼62.5/125um，插入損耗≦0.3dB，回波損耗≧35dB。實(shí)驗(yàn)中電子成像設(shè)備由倒置顯微鏡的顯微成像系統(tǒng)所組成，通過將其與電腦連接，實(shí)驗(yàn)人員可以在計(jì)算機(jī)屏幕中實(shí)時(shí)記錄神經(jīng)細(xì)胞突起的生長軌跡，監(jiān)控激光引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的過程。

圖 1 光纖激光束引導(dǎo)裝置三維結(jié)構(gòu)示意圖

1.4激光引導(dǎo)方法 選取突起生長旺盛的PC12細(xì)胞用于激光引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，將目標(biāo)細(xì)胞移至視野中央，光纖固定于三維微操之上，通過操作微操將光纖尖端放置在細(xì)胞生長活躍的突起一側(cè)，使激光束照射方向與突起自然生長方向垂直，呈約90°（圖2）。倒置顯微鏡下觀察，通過顯微照相系統(tǒng)每隔5min拍攝一張圖片，連續(xù)觀察30min，記錄神經(jīng)細(xì)胞突起在激光引導(dǎo)過程中的生長軌跡。

圖 2 顯微鏡下激光束方向與生長錐原始生長方向相對位置的示意圖（a）和照片（b）。

突起生長過程中，由于激光以及其他因素的影響，其生長方向與位置會(huì)時(shí)刻發(fā)生變化，因此每隔2min，光纖末端的位置也需隨著神經(jīng)元突起的方向與位置移動(dòng)，使激光照射方向與突起始終保持在近似垂直位。但是光纖末端在定位或者移動(dòng)過程中始終不能接觸細(xì)胞和突起的任何部位以及培養(yǎng)皿的表面。同時(shí)在激光引導(dǎo)的整個(gè)過程中最大程度遮蔽自然光，關(guān)閉其他光源，以排除成分復(fù)雜的自然光或者燈光的干擾。

1.5數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)中所有拍攝的圖片均由OLYMPUS顯微照相機(jī)拍攝。放大倍數(shù)400×；像素4080×3072；大?。焊摺翆?18cm×23cm。照片首先均由Adobe Photoshop CS5 進(jìn)行初步剪切，調(diào)色處理，處理后圖片大小為：高×寬=1.8cm×2.3cm。最后測量統(tǒng)計(jì)突起生長狀況和偏轉(zhuǎn)角度。

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 PC12細(xì)胞接種初期，細(xì)胞呈圓形，無突起，光暈明顯，分布均勻。接種12h后細(xì)胞基本貼壁，先前分散的細(xì)胞呈現(xiàn)抱團(tuán)生長，部分細(xì)胞可觀察到細(xì)胞突起生長（圖3-a）。24h后，大部分細(xì)胞可見突起生長，有的突起較長且增粗，末端膨大呈傘狀，其上有若干偽足時(shí)刻變換形狀與位置（圖3-b）。在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察20min，可見部分突起生長了近5μm。接種48h后，可見PC12 細(xì)胞出現(xiàn)多個(gè)突起，數(shù)目不等，其中有較長、直徑較粗，類似神經(jīng)元軸突樣突起，其長度可達(dá)PC12細(xì)胞胞體直徑的2～3倍，可見PC12細(xì)胞已成功向神經(jīng)細(xì)胞樣分化（圖3-c）。

圖 3 接種后的PC12細(xì)胞

注：a、b、c分別為接種12h、24h、48h后PC12細(xì)胞（Scale=20μm）

2.2激光引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 選取30例胞質(zhì)均勻、立體感強(qiáng)、突起完好、生長旺盛接種24h后的PC12細(xì)胞用于光纖激光引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。顯微照相系統(tǒng)每隔1min拍攝一張照片，連續(xù)觀察30min，記錄細(xì)胞突起的生長軌跡。

如表1、圖4所示，在激光引導(dǎo)過程中67%生長活躍的突起都可以在5min內(nèi)被波長為800nm的激光影響。若以偏轉(zhuǎn)角度（突起偏離原始生長方向的角度） 大于10°為低限，則20例中有13例PC12細(xì)胞的突起跟隨光纖激光束生長（圖5-a、b）。其中，偏轉(zhuǎn)角度在30°以下的有7例，偏轉(zhuǎn)角度在30°～60°的有4例，偏轉(zhuǎn)角度在60°及以上的有2例，其中最大偏轉(zhuǎn)角度可達(dá)100°以上。

除突起跟隨激光束生長外，實(shí)驗(yàn)中亦存在突起在激光照射后背向激光束的方向生長（圖5-c）或者突起向胞體方向回縮的現(xiàn)象，分別占10%（3例）和13%（4例）。同時(shí)，在30例細(xì)胞中有33%（10例）細(xì)胞突起的生長不受光纖激光束的影響，在激光引導(dǎo)的30min內(nèi)既不跟隨激光束，也不背向激光束，而是依據(jù)其原始的生長方向繼續(xù)生長或停止生長。

圖 4激光對PC12細(xì)胞突起生長引導(dǎo)結(jié)果（Scale=20μm）

注：每一組中的五張照片分別在激光照射后即刻、6min、12min、21min、30min的拍攝。

如圖所示，a、b為兩例突起跟隨光纖激光束生長的PC12細(xì)胞。照片顯示了激光引導(dǎo)突起偏轉(zhuǎn)的過程。a、b2例突起偏轉(zhuǎn)角度均大于45°，a偏轉(zhuǎn)大于90°。c為1例突起在激光照射后背向激光束引導(dǎo)方向生長PC12細(xì)胞。

3 討論

\"激光陷阱\"（optical traps）又名\"光鑷\"（optical tweezers ），可以實(shí)現(xiàn)對生物活體樣品非接觸無損傷的捕獲和操縱，自誕生至今20多年以來，廣泛應(yīng)用于微觀科學(xué)領(lǐng)域 。激光陷阱由激光發(fā)射裝置發(fā)射一定波長和頻率的激光，穿過倒置顯微鏡下方的物鏡在載物臺(tái)形成一個(gè)類似光環(huán)的陷阱。在其光路傳輸過程中，經(jīng)物鏡，空氣，培養(yǎng)皿底等介質(zhì)的反射與折射，存在不同程度的能量消耗。

本實(shí)驗(yàn)光纖激光引導(dǎo)裝置與傳統(tǒng)激光陷阱最大的區(qū)別在于，其激光束不再通過顯微鏡物鏡本身的光路途徑到達(dá)載物臺(tái)，而是通過光纖引導(dǎo)投射于靶區(qū)域。實(shí)驗(yàn)中光纖激光束引導(dǎo)裝置采用NARISHIGE三軸水壓微操鏈接光纖夾持器，通過對微操的調(diào)節(jié)，控制光纖末端的位置、角度、以及它的運(yùn)動(dòng)，準(zhǔn)確放置在神經(jīng)細(xì)胞生長錐附近的任意區(qū)域，使激光束通過光纖末端傳導(dǎo)精確定位于生長錐附近的靶區(qū)域內(nèi)，引導(dǎo)其定向生長。實(shí)驗(yàn)所配置的光纖夾持器滿足了光纖微/納米級的移動(dòng)以及其良好的穩(wěn)定性。

已有的研究證明780～830nm紅外線波長的激光對神經(jīng)的修復(fù)再生具有較好的生物刺激作用。本實(shí)驗(yàn)中光纖激光引導(dǎo)裝置所采用的激光發(fā)射器可產(chǎn)生波長為800nm，能量在0～500mw范圍內(nèi)的激光，激光強(qiáng)度通過調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)整，并實(shí)時(shí)在激光發(fā)射器的屏幕上顯示當(dāng)前的激光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)所采用的光纖可傳輸波長為（800±50）nm，能量在0～150mW范圍內(nèi)。為使引導(dǎo)方向更加精確，光纖尖端被拉制成為錐形，其末端直徑經(jīng)測量約為5～10μm，與神經(jīng)元生長錐直徑相宜。同時(shí)光纖具有的光全反射特性，使其傳導(dǎo)最大程度上保留了激光的能量，減少了激光束自激光發(fā)射器產(chǎn)生至投射于生長錐這一傳輸過程中的能量損耗，便于在引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)過程中更為精確地控制激光強(qiáng)度。此外，光纖引導(dǎo)完全脫離顯微鏡本身的物鏡光路途徑，擺脫固定光路的束縛，使引導(dǎo)更為靈活。其在三維空間中的自由度為構(gòu)建以及修復(fù)活體組織中復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)提供了可能。

當(dāng)生長錐某區(qū)域被激光束照射時(shí)，激光束自光纖末端發(fā)出后呈扇形輻射在這一區(qū)域。根據(jù)Ehrlicher等學(xué)者的實(shí)驗(yàn)，分布在生長錐此區(qū)域邊緣的激光強(qiáng)度必須足夠大，方能引起肌動(dòng)蛋白聚合反應(yīng)，使生長錐朝此方向偏轉(zhuǎn)[1]。但是為了控制突起生長的方向，生長錐需持續(xù)跟隨激光束生長，所以突起的生長不需要過多的聚合反應(yīng)，大量的聚合反應(yīng)將阻礙生長錐的進(jìn)一步生長。因此掌握生長錐邊緣特定區(qū)域內(nèi)激光的輻射強(qiáng)度，是成功引導(dǎo)生長錐跟隨激光引導(dǎo)方向生長的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)激光強(qiáng)度小于1mw時(shí)，生長錐往往不容易被激光引導(dǎo)，當(dāng)激光強(qiáng)度大于5mw，約5min之內(nèi)， 生長錐被激光束照射的區(qū)域?qū)⒆兒窕蛘呙芏仍黾樱稍诠忡R下觀察到生長錐此部分顏色加深的畫面），生長錐開始改變原有生長方向。如果繼續(xù)增加激光強(qiáng)度至45mw時(shí)，這一區(qū)域生長錐生長將停滯。且光纖激光引導(dǎo)結(jié)果中，除突起跟隨激光束生長外，亦存在突起在激光照射后背向激光束的方向生長或者突起向胞體方向回縮的現(xiàn)象。

光纖末端的直徑大小是激光精確引導(dǎo)的關(guān)鍵因素。若光纖末端直徑過大，激光束在光線末端將產(chǎn)生一個(gè)較大的散射角，在實(shí)驗(yàn)中常常會(huì)覆蓋整一個(gè)生長錐，引導(dǎo)效果將難以控制。若選擇末端直徑較小的光纖，它自身重量和液面張力會(huì)使光纖彎曲，同時(shí)，在微操調(diào)節(jié)光纖位置時(shí)，輕微的震顫都將引起光纖末端的\"大幅度搖擺\"，相對于脆弱的細(xì)胞而言這無疑是極大的破壞。因此本實(shí)驗(yàn)選用直徑為125μm的silica光纖，經(jīng)測試，其硬度適宜。在放大鏡下剝?nèi)ス饫w末端1cm的保護(hù)套后，于酒精燈上拉制，使其末端呈錐形且錐形尖端直徑在5～10μm。激光的折射率在空氣中為1，在水中為1.3，在富含各種營養(yǎng)物質(zhì)的DMEM培養(yǎng)液中折射率更高。并將光纖浸入細(xì)胞培養(yǎng)液，測量波長為800nm的激光經(jīng)光纖傳導(dǎo)投射在培養(yǎng)液中的散射角度，約為（90°±10°）。

圖 5 顯微鏡下光纖錐形尖端及激光束

注：如圖所示為激光經(jīng)光纖錐形尖端傳導(dǎo)，投射在培養(yǎng)皿底部的扇形區(qū)，其投射的扇形散角為90°±10°。圖中激光的強(qiáng)度被增強(qiáng)，使扇形投射區(qū)可以清楚顯現(xiàn)。

由于光纖末端不能接觸生長錐邊緣任何區(qū)域，它必需與生長錐邊緣存在一定距離，激光在這段距離的培養(yǎng)液中存在一定的能量損耗。因此激光束扇形輻射的各個(gè)區(qū)域內(nèi)，激光強(qiáng)度皆不相同，生長錐處于扇形內(nèi)不同區(qū)域可能會(huì)產(chǎn)生不同的反應(yīng)。如本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的突起跟隨、背向激光引導(dǎo)方向生長以及突起回縮等引導(dǎo)結(jié)果。

生長錐生長及轉(zhuǎn)向通過神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架的活動(dòng)來實(shí)現(xiàn)。光纖激光引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞突起定向生長的機(jī)制尚無定論。依據(jù)目前研究可知，光纖激光束引導(dǎo)裝置所產(chǎn)生的光作用力可分為兩部分：一種是梯度力，將粒子拉向光場增強(qiáng)的方向；另一種是散射力，將粒子推向光傳播的方向。光纖激光束裝置的激光發(fā)射器產(chǎn)生波長為800nm的激光，耦合于光纖傳輸。光纖的末端經(jīng)拉制后呈尖端口徑為5～10μm的錐形，激光從錐形末端輸出，作用于生長錐。該錐形光纖相當(dāng)于傳統(tǒng)光鑷中的顯微物鏡，將光束會(huì)聚。但錐形光纖的徑向方向，光場梯度力仍起主導(dǎo)作用，作用力指向軸線。生長錐內(nèi)肌動(dòng)蛋白微粒受激光梯度力和散射力的影響在生長錐邊緣聚集，從而發(fā)生聚合和解聚反應(yīng)，使生長錐偽足朝激光方向延伸，生長錐跟隨激光生長。

另外具有一定能量的光子激光照射在生長錐上會(huì)引起局部溫度上升，溫度是否是激光引導(dǎo)生長錐偏轉(zhuǎn)的原因？有研究表明：波長為800nm的激光在水中或者DMEM中連續(xù)照射僅僅引起局部溫度較小的上升，與環(huán)境溫度相比甚至可以忽略不計(jì)[4]。因此，激光照射過程中，生長錐局部溫度的變化可能不是引起生長錐受激光影響而偏轉(zhuǎn)的原因之一。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過創(chuàng)新設(shè)計(jì)的光纖激光束引導(dǎo)裝置將波長為800nm的激光通過光纖引導(dǎo)投射于PC12細(xì)胞生長錐的一側(cè)，精確引導(dǎo)其生長方向。結(jié)果提示該光纖激光引導(dǎo)裝置可以用于引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞突起的定向生長，且引導(dǎo)方向精確，結(jié)構(gòu)簡單靈活，其在三維空間中的自由度亦為構(gòu)建以及修復(fù)活體組織中復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)提供了可能。

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