三種鑒定葡萄球菌凝固酶方法的比較

摘要：目的 評(píng)價(jià)3種鑒定葡萄球菌凝固酶方法的敏感性和特異性。方法 臨床分離的110株葡萄球菌，經(jīng)過(guò)革蘭染色，顯色培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)，觸酶試驗(yàn)，VITEK32鑒定后，用試管法、玻片法、商品乳膠血凝法（slidex staph-kit），鑒定葡萄球菌和評(píng)價(jià)凝固酶試驗(yàn)方法。3種方法結(jié)果不一致的菌株進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。用兔血漿試管法作為標(biāo)準(zhǔn)，比較其它凝固酶方法的敏感性、特異性。結(jié)果 兔血漿試管法檢測(cè)到65株陽(yáng)性菌株，以此為標(biāo)準(zhǔn)，兔血漿玻片法有3株假陽(yáng)性，人血漿玻片法和乳膠血凝法的假陽(yáng)性分別為8株和2株。人血漿試管法的鑒定符合率為100%，其余各種方法的敏感性均為100%，而特異性（兔血漿和人血漿玻片法，乳膠凝集試驗(yàn)）分別為95.6%，88%，和98.5%。結(jié)論 人血漿凝固酶試管法敏感性特異性均較高，是鑒定葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)的好方法，適合于各基層臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)葡萄球菌的鑒定。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶；乳膠試劑

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，然而臨床標(biāo)本中金黃色葡萄球菌鑒定中往往困擾者廣大檢驗(yàn)工作者，血漿凝固酶試驗(yàn)是鑒定金黃色葡萄球菌的重要方法之一。鑒定的準(zhǔn)確性直接關(guān)系到進(jìn)一步上機(jī)鑒定及藥敏試驗(yàn)判斷及MRS紙片法篩選判斷。凝固酶分為兩種：游離性凝固酶，結(jié)合型凝固酶，游離型凝固酶常用試管法鑒定，結(jié)合型凝固酶常用玻片法鑒定。隨著現(xiàn)代微生物技術(shù)的不斷發(fā)展，許多醫(yī)院開始選用法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的葡萄球菌乳膠凝集試劑作為檢出金黃色葡萄球菌的常規(guī)篩選試驗(yàn)試劑，雖然乳膠試劑盒簡(jiǎn)便，快速，但是易出現(xiàn)假陽(yáng)性且價(jià)格昂貴。為尋找一種適合廣大基層醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室對(duì)葡萄球菌鑒定經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)便的鑒定方法。本文以兔血漿試管法為標(biāo)準(zhǔn)[1]，對(duì)110株臨床分離的葡萄球菌凝固酶分別進(jìn)行兔血漿，人血漿凝固酶試驗(yàn)和乳膠凝集試驗(yàn)。評(píng)價(jià)其敏感性，特異性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源 110株葡萄球菌均來(lái)自于我院2011年12月～2013年9月臨床分離菌株，保存于-20℃低溫冰箱，實(shí)驗(yàn)前接種于5%羊血基礎(chǔ)平板，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌落進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2菌株鑒定 以上所有菌株都經(jīng)革蘭染色，觸酶試驗(yàn)，顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，血漿凝固酶試管法和VITEK32微生物自動(dòng)鑒定。

1.1.3質(zhì)控菌株 以金黃色葡萄球菌ATCC25923作為陽(yáng)性對(duì)照菌株，表皮葡萄球菌ATCC26069為陰性對(duì)照菌株。購(gòu)于云南省臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.4其它試劑、材料

1.1.4.1兔血漿，上海市疾病控制中心生產(chǎn)商品試劑（批號(hào)：20130129）。

1.1.4.2乳膠試劑盒 （slidex staph-kit）法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)。

1.1.4.3人血漿制備 取30例外觀清亮體檢（肝、腎功，血糖、血脂均正常）肝素抗凝血制備成混合血漿低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4.4其它材料 所用試管、燒杯均洗凈后高壓滅菌消毒后備用，玻片均用新玻片消毒滅菌后備用。

1.2方法 將葡萄球菌接種于血平板，經(jīng)過(guò)18～24h 培養(yǎng)后，分別采用兔血漿，人血漿，乳膠試劑進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.1玻片法試驗(yàn) 取1滴生理鹽水置玻片上，挑取待測(cè)細(xì)菌，在生理鹽水中制成菌懸液；取血漿1滴置玻片上與菌懸液混勻，10s內(nèi)見到明顯凝塊，而生理鹽水中無(wú)凝集現(xiàn)象者為陽(yáng)性；試驗(yàn)同時(shí)做陽(yáng)性，陰性對(duì)照[2]。

1.2.2試管法試驗(yàn) 混合血漿用生理鹽水稀釋4倍，取0.5ml加被鑒定葡萄球菌數(shù)個(gè)菌落，混合后放35℃孵箱，3～4h記錄結(jié)果，若陰性，然后再放置24h，再觀察記錄結(jié)果。觀察時(shí)，將試管從垂直位緩慢傾斜90°，觀察試管中凝集的形成。同時(shí)做陰性、陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3膠凝集試驗(yàn) 先將致敏的乳膠顆粒試劑充分混勻，在一次性卡片的兩個(gè)不同區(qū)域各加1滴致敏試劑，然后用接種環(huán)挑取待測(cè)的葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物加入試驗(yàn)區(qū)，對(duì)照區(qū)則加1滴對(duì)照試劑，輕輕混勻、乳化，觀察結(jié)果。30s內(nèi)，試驗(yàn)側(cè)凝集，而對(duì)照側(cè)無(wú)凝集時(shí)，可判斷為陽(yáng)性。試驗(yàn)同時(shí)做陽(yáng)性、陰性對(duì)照。其他所有操作方法均按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]執(zhí)行。

2 結(jié)果

2.1三種方法檢測(cè)葡萄球菌的結(jié)果見表1。

2.2 以兔血漿試管法為標(biāo)準(zhǔn)，比較其它試驗(yàn)方法的敏感性和特異性（見表2）。

2.3從以上可知3種方法檢出凝固酶陽(yáng)性的葡萄球菌除人血漿玻片法檢出率較高外66.4%，其它方法的檢出率均無(wú)太大差異。兔血漿試管法檢測(cè)到65株陽(yáng)性菌株，以此為標(biāo)準(zhǔn)，兔血漿玻片法有3株假陽(yáng)性，人血漿玻片法和乳膠血凝法的假陽(yáng)性分別為8株和2株。人血漿試管法的鑒定符合率為100%，其余各種方法的敏感性均為100%，而特異性（兔血漿和人血漿玻片法，乳膠凝集試驗(yàn)）分別為95.6%，88%，和98.5%。

3 討論

金黃色葡萄球菌是常見的致病菌，正確鑒定金黃色葡萄球菌較為重要。血漿凝固酶試驗(yàn)是檢測(cè)金黃色葡萄球菌的關(guān)鍵。致病性較強(qiáng)的金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著于細(xì)菌表面成塊，凝塊包繞細(xì)菌，使其免遭抗生素，抗體，吞噬等多種因素的作用。葡萄球菌有兩種凝固酶，一種是與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合的凝固酶，即凝集因子，它可直接作用于纖維蛋白原，可用玻片法檢出；另外一種是菌體釋放到培養(yǎng)基中的游離凝固酶，它可以與血漿中的凝固酶反應(yīng)因子協(xié)同作用于纖維蛋白原，使血漿凝固，故可用試管法檢出。凝集因子試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)是兩個(gè)不相關(guān)試驗(yàn)，兩者不能相互代替，也不可以相互印證。

本次試驗(yàn)可以看出除血漿凝固酶試管法沒有假陽(yáng)性外，其它方法都存在假陽(yáng)性。血漿凝固酶玻片放的假陽(yáng)性明顯較高（兔血漿68例，人血漿73例），其特異性較差。原因可能是由于人血漿中產(chǎn)生的自身抗體或血漿中的抗凝劑所致。所以在玻片法檢測(cè)結(jié)合型凝固酶時(shí)，應(yīng)注意用蒸餾水代替生理鹽水稀釋血漿，因?yàn)槠咸亚蚓鷮?duì)鹽敏感，特別是不能使用高鹽培養(yǎng)基，血漿不能過(guò)多，一般是1滴，1接種環(huán)血漿，4接種環(huán)蒸餾水混勻，可減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)。

乳膠凝集試驗(yàn)中也存在著假陽(yáng)性，可能是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌細(xì)胞壁中的蛋白A含量過(guò)高而導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)[4]。乳膠凝集試驗(yàn)是用提純IgG的FC段與金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）結(jié)合，反應(yīng)機(jī)制是雙鏈?zhǔn)?，所以避免了某些金黃色葡萄球菌游離凝固酶或SPA產(chǎn)生足主所致的假陰性；它用于檢測(cè)凝集因子和蛋白質(zhì)A的乳膠混合血漿試劑，大大地提高了檢測(cè)凝集因子的特異性。

而此次試驗(yàn)中試管法檢測(cè)葡萄球菌凝固酶的敏感性與特異性均較高，并且人血漿與兔血漿所檢出凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌菌株符合率為100%，無(wú)假陽(yáng)性與假陰性出現(xiàn)。主要是由于試管法檢測(cè)的是游離型凝固酶，是菌體釋放到培養(yǎng)基中的，它可以與血漿中的凝固酶反應(yīng)因子協(xié)同作用于纖維蛋白原使血漿凝固，但是試驗(yàn)中血漿應(yīng)做4倍稀釋，結(jié)果觀察應(yīng)在35℃溫育24h后。

從此次試驗(yàn)可知，在快速鑒定葡萄球菌時(shí)，應(yīng)選用兔血漿作玻片法凝固酶試驗(yàn)或選用乳膠試劑做鑒定，但不能作為確證試驗(yàn)。人血漿凝固酶試管法敏感性特異性均較高，是鑒定葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)的好方法，適合于各基層臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)葡萄球菌的鑒定。

參考文獻(xiàn)：

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[2]高屹.如何做好葡萄球菌凝集因子試驗(yàn)[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1999，22（增刊）：43.

[3]葉應(yīng)嫵，王毓三.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].2版.南京：東南大學(xué)出版社，1992：182-183.

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編輯/王敏