呼吸道病毒檢測方法的臨床研究

摘要：近幾年的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果已經(jīng)真實，95%的上呼吸道感染、大部分的下呼吸道感染疾病均為細(xì)菌外病原所引起，其中以病毒感染最為常見，在臨床診斷中，對呼吸道病毒進(jìn)行檢測的診斷意義顯著。本文出于對呼吸道病毒檢測方法的發(fā)展情況進(jìn)行分析的目的，對病毒分離培養(yǎng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、免疫技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定法等進(jìn)行了具體闡述。

關(guān)鍵詞：呼吸道感染；病毒；檢測方法；研究進(jìn)展

所謂的呼吸道病毒就是在可以對呼吸道造成侵犯，誘發(fā)呼吸道局部病變，引起呼吸道組織器官病變的一種病毒。現(xiàn)階段的研究顯示，呼吸道病毒為人類發(fā)病與死亡的主要危險因素之一，已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注[1]。近幾年對傳染性疾病的不斷研究中發(fā)現(xiàn)，病毒亞型、致病力以及患者的臨床表現(xiàn)均發(fā)生了較大的變化，因此對呼吸道病毒的檢測手段進(jìn)行了解，并開展快速的病毒檢測手段具有很大的必要性，應(yīng)引起重視。本文對現(xiàn)階段呼吸道病毒檢測手段的具體形式進(jìn)行了綜述，詳見下文。

1病毒分離培養(yǎng)

對于病毒檢測工作而言，分離培養(yǎng)為目前最為經(jīng)典的一種手段，其主要操作為[2]：對患者的鼻咽分泌物進(jìn)行常規(guī)處理，接種在敏感細(xì)胞上，并在含有2%小牛血清的MEN培養(yǎng)基中進(jìn)行生長，在37℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，并對細(xì)胞的連續(xù)變化進(jìn)行觀察，若是出現(xiàn)特征病變則視為陽性。經(jīng)盲傳3代后依舊未出現(xiàn)病變則證實為陰性。實踐證實，盡管該手段具有較強的特異性，但是檢測成本相對較高，在早期診斷以及疫情控制中不適合。

2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

所謂的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）就是可直接對病原體核酸進(jìn)行檢測的一種手段，其可以在感染的早期針對可疑病例展開及時準(zhǔn)確的診斷。實踐中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的PCR檢測僅可以一次從標(biāo)本中檢出一種病毒，針對RNA病毒需展開逆轉(zhuǎn)錄，針對還未明確的病毒感染便無法下手，近段時間，PCR技術(shù)得到了一定的改進(jìn)，包括多重實時定量PCR技術(shù)和巢式PCR技術(shù)等[3]。以下作詳細(xì)介紹

2.1多重實時定量PCR 在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上將熒光標(biāo)記探針予以引入，使得PCR反應(yīng)與擴增產(chǎn)物的檢測工作可以同時完成，實現(xiàn)了實時定量檢測，并且閉管檢測也使傳統(tǒng)PCR技術(shù)需應(yīng)用電泳得到了避免，減少了標(biāo)本污染機會；多重PCR技術(shù)可以在同一個PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入兩對或兩對以上的引物，同時可以擴增出多個核酸片段，在多種病毒的檢測中均具有良好的效果，高效且系統(tǒng)。曾有學(xué)者經(jīng)多重PCR技術(shù)對急性呼吸道感染患兒展開了呼吸道標(biāo)本中病毒檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性率為47.0%，較常規(guī)檢測方法高2倍以上[4]。

2.2巢式PCR 該項技術(shù)術(shù)語聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一種變異，經(jīng)兩對PCR引物可擴增出完整的片段。該項技術(shù)的主要優(yōu)勢為：若是第一次擴增出錯，則第2段可以在錯誤的片段上進(jìn)行引物配對，擴增的概率相對較低，具有較高的特異性[5]。

3免疫技術(shù)

3.1直接免疫熒光法 對于該項技術(shù)而言，其主要原理為經(jīng)熒光素對病原抗體進(jìn)行直接標(biāo)記，從而形成特異性熒光抗體，而后經(jīng)該抗體同細(xì)胞或者是組織中的抗原進(jìn)行結(jié)合。在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，便可以獲得結(jié)果。

3.2間接免疫熒光法 該項檢測手段的主要原理為：首先經(jīng)特異性抗體同標(biāo)本中的抗原進(jìn)行結(jié)合，產(chǎn)生抗原-抗體的復(fù)合物，而后經(jīng)間接熒光抗體同該復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合，形成抗原-特異性抗體-間接熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，以復(fù)合物的發(fā)光情況為依據(jù)對檢測的抗原進(jìn)行判斷。該檢測手段的操作檢點，特異性較高，可以實現(xiàn)多種病毒的同時檢測，然實踐中發(fā)現(xiàn)，其敏感性相對較低，由于參與的組分較多，因此容易受到干擾，應(yīng)引起注意。

3.3抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)法 抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)法（APAAP）的主要原理為第一抗體同待測抗原進(jìn)行特異性的結(jié)合，而后第二抗體產(chǎn)生顯著的橋聯(lián)效果，其中Fab段同第一抗體連接，另一段則是與AP-AAP復(fù)合物進(jìn)行連接，經(jīng)AP-AAP復(fù)合物中的堿性磷酸酶催化底物進(jìn)行顯色，從而達(dá)到鑒定抗原的效果。

4酶聯(lián)免疫吸附法

ELISA法為臨床上比較常用的一種檢測手段，其主要是利用將一種抗原-抗議免疫反應(yīng)同酶的高效催化作用進(jìn)行有機結(jié)合，通過對酶與底物的顯色反應(yīng)對檢測結(jié)果進(jìn)行判斷，特異性與敏感性均較高，臨床應(yīng)用廣泛。

5其他技術(shù)

由于諸多新的呼吸道病毒被不斷的發(fā)現(xiàn)，使得實驗室檢測工作面臨著巨大的挑戰(zhàn)，因此開發(fā)與發(fā)展多種呼吸道病毒感染檢測技術(shù)具有很大的必要性，近幾年相繼有基因芯片技術(shù)、懸浮陣列技術(shù)等問世，其在病毒檢測中的效果還有待進(jìn)一步研究，值得對其給予關(guān)注。

參考文獻(xiàn)：

[1]周一平，陸學(xué)東，陳小可，等.呼吸道病毒與成人下呼吸道感染相關(guān)性探討[J].中華實用診斷與治療雜志，2010，12（02）：347-349.

[2]石晶，孔曉慧.PCR技術(shù)在呼吸道病毒檢測中的應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2011，21（17）：982-983.

[3]徐軍，郭靜霞，李浩，等.不明原因呼吸道感染疫情病原學(xué)分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，35（03）：252-255.

[4]Sung RY， Chan PK， Tsen T， et al. Identification of viral and atypical bacterial pathogens in children hospitalized with acute respiratory infec-tions in Hong Kong by multiplex PCR assays[J]. Journal of Medical Virology，2009，12（14）：287.

[5] Mahony JB. Detection of respiratory viruses by molecular methods[J]. Clinical Microbiology Reviews，2011，11（04）：211-213.

編輯/許言