懸浮培養(yǎng)法分離人前列腺癌PC—3細胞系類干細胞的實驗研究

摘要：目的 從人前列腺癌PC-3細胞系中分離鑒定前列腺癌干細胞。方法 分別用含血清及無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌細胞系PC-3細胞，采用流式細胞術檢測細胞中前列腺癌類干細胞的比例。結果 PC-3細胞可以在無血清培養(yǎng)液中生存并形成可以穩(wěn)定傳代的懸浮細胞球，細胞中CD44+、CD133+及SP細胞比例均顯著高于PC-3貼壁細胞的比例。結論 通過無血清懸浮聚球培養(yǎng)可以從PC-3細胞中簡便、高效地分離出前列腺癌類干細胞。

關鍵詞：前列腺癌；懸浮培養(yǎng)法；干細胞

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，通過手術切除、放療和內分泌治療等。傳統(tǒng)治療手段雖然可以獲得較好的早期療效，但并不能完全阻止前列腺癌的進展和復發(fā)。腫瘤干細胞（tumor stem cells，TSC）被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移和復發(fā)的根源[1]。已有學者分別從乳腺癌和腦腫瘤等實體瘤中成功分離出相應的TSC。本文采用添加了生長因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌類干細胞，再通過流式細胞儀檢測其中具有干細胞特性的陽性細胞比例，并進一步鑒定其增殖等特性，從而為進一步深入研究人前列腺癌干細胞（human prostate cancer stem cell，hPCSC）奠定基礎，為前列腺癌的臨床診治提供新的思路。

1資料與方法

1.1一般資料 人前列腺癌PC-3細胞購自中國科學院昆明細胞庫。含血清培養(yǎng)基（serum-supple-mented medium， SSM）為含10%特級胎牛血清（中國BD公司）的DMEM/F12（1B1，美國Invitrogen/Gibc公司）培養(yǎng)基，并添加2 mmol/L L-谷氨酰胺（美國Sigma公司）；無血清培養(yǎng)基（serum-free medium， SFM）為不含胎牛血清的DMEM/F12（1B1）培養(yǎng)基，并添加2 mmol/L L-谷氨酰胺、人表皮生長因子（human epidermal growth factor，EGF）、人堿性成纖維生長因子（human basic fibroblast growth factor，bFGF）等。流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）、全自動熒光酶標儀（美國Thermo公司）等均由中科院昆明動物研究所提供。

1.2方法

1.2.1前列腺癌PC-3細胞的培養(yǎng) 將PC-3細胞接種于50 mL玻璃培養(yǎng)瓶，添加SSM，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2前列腺癌類干細胞球的培養(yǎng)分化 將處于對數生長期的貼壁細胞進行消化、重懸于SFM中，每個培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)1×104個細胞，每天間斷搖動培養(yǎng)皿，以阻止細胞貼壁，半量換取培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，更換1次/2～3 d。待培養(yǎng)皿中細胞增殖、形成懸浮細胞球后進行收集，吹打成單細胞懸液并按1∶2傳代。分別于細胞接種后5 d、10 d、15 d統(tǒng)計直徑超過60 um的懸浮細胞球數目，選取5個連續(xù)視野，用平均法計算PC-3懸浮細胞球的形成率。每2～3 d向形成懸浮細胞球的SFM中滴加FBS，在SSM和SFM中交替培養(yǎng)PC-3成球細胞，觀察并記錄PC-3成球細胞的生長方式。

1.2.3流式細胞學分選CD44+、CD133+及SP細胞 以PC-3懸浮成球細胞為實驗組，以PC-3單層貼壁細胞為對照組。將兩種細胞重懸為單細胞懸液，進行染色。應用熒光激活細胞分選法和紫外光激發(fā)后雙波長分析法檢測CD44+、CD133+及SP細胞比例。染色嚴格依照廠商說明書上標示的操作流程。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數加減標準差（x±s）表示，計數資料用頻數（n）或率（%）表示，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1前列腺癌類干細胞球的形成 將前列腺癌PC-3細胞接種于SFM后，大多數細胞呈懸浮生長狀態(tài)，發(fā)生凋亡的細胞為極少數。接種3 d后少量體積較小的腫瘤細胞集成球團，球團大小不等，由5～15個PC-3細胞組成，圓形、具有折光性，結合松散。5～6 d后，懸浮的腫瘤細胞球團增多增多，細胞間結合較緊密。培養(yǎng)1 w后，細胞球團的變成圓形，細胞球團上有新生細胞生長，出芽方式生長為主。約7 d傳代，傳代后的細胞約4 d后形成新的不規(guī)則細胞球，以后逐漸變得規(guī)則。

2.2 PC-3懸浮成球細胞的自我更新與分化 收集PC-3懸浮細胞球，吹散、重懸為單細胞懸液后再次接種于SFM中，5～7 d后仍可形成細胞球。經連續(xù)傳代，細胞球形成率基本穩(wěn)定（P>0.05）。在SFM中滴加FBS后細胞球變小，底部邊緣細胞從細胞球中貼壁快速生長，7 d后基本上看不到細胞球，完全顯示為貼壁生長的單細胞。

2.3 PC-3懸浮成球細胞中CD44+、CD133+細胞和SP細胞的比例 統(tǒng)計結果顯示，PC-3懸浮成球細胞CD44+、CD133+細胞的比率為9.62%，SP細胞比率為2.19%，均高于貼壁細胞，差異具有顯著性（P<0.05）。

3討論

隨著環(huán)境的污染，前列腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，其病死率也在逐年上 升[2]。前列腺癌的治療以手術切除為主，結合放療和內分泌治療，有一定的療效，但部分前列腺癌進展為雄激素非依賴性前列腺癌（androgen independent prostate cancer，AIPC），目前臨床尚無有效的治療方法，大量文獻證實前列腺癌干細胞是引發(fā)雄激素非依賴性前列腺癌的原因之一[3]。腫瘤干細胞可自我更新、多向分化和無限增殖，是形成腫瘤的起始細胞并維持腫瘤的生長，其對化療、放療均不敏感[4]?，F有的治療手段只以殺滅前列腺癌細胞，無法殺滅前列腺癌干細胞，導致前列腺癌繼續(xù)進展。并且前列腺癌干細胞比例極低，分化快，缺乏特異性標志物，嚴重阻礙了對其表型、功能及遺傳學特征的深人研究。

本研究通過將前列腺癌PC-3細胞置于SFM中培養(yǎng)，發(fā)現只有少數未分化的前列腺癌PC-3細胞能形成前列腺癌類腫瘤干細胞球團，而大部分已分化的前列腺癌PC-3細胞相繼凋亡；培養(yǎng)時間越長，前列腺癌干細胞球團呈增大狀態(tài)，7 d傳代后可繼續(xù)增殖，形成新的細胞球，證明前列腺癌類干細胞可自我更新及增殖。CD44+和CD133+是前列腺癌干細胞的特異性標志物。我們通過檢測PC-3懸浮成球細胞CD44mRNA和CD133mRNA的相對表達量分別是PC-3單層貼壁細胞的數倍，提示成球細胞中富集了前列腺癌干細胞。SP細胞存在于多種成體組織、胚胎細胞及腫瘤細胞中，具有自我更新和多向分化潛能，是一種干細胞樣的細胞群，可以在體內分化成不同組織類型的細胞。分選SP細胞分選可以分離和鑒定腫瘤干細胞，不需要特定的細胞表面標記物。本研究中，SP細胞比率為2.19%，和Oates（2009）等[5]研究結果基本一致。

綜上所述，采用懸浮培養(yǎng)法分離人前列腺癌PC-3細胞系類干細胞，簡便、高效，可進一步研究前列腺癌干細胞生物學特性，為臨床診斷及治療前列腺癌提供實驗室依據和幫助。

參考文獻：

[1]Wang G， Wang Z， Sarkar F H， et al. Targeting prostate cancer stem cells for cancer therapy[J].Discov Med，2012，13（69）：135-142.

[2]上海市疾病預防控制中心.上海市市區(qū)1983-2008年惡性腫瘤發(fā)病率[J].腫瘤，2011，31（12）：1115.

[3]Yu C， Yao Z， Jiang Y， et al. Prostate cancer stem cell biology[J].Minerva Urol Nefrol，2012，64（1）19-33.

[4]Ottinger S， Kloppel A， Rausch V， et al. Targeting of pancreatic and prostate cancer stemcell characteristics by Crambe crambe marine sponge extract[J].Int J Cancer，2012，130（7）：1671-1681.

[5]Oates JE， Grey BR， Addla SK， et al. Hoechst 33342 side population identification is a conserved and unified mechanism in urological cancers[J].Stem Cells Dev，2009，18（10）：1515-1522.編輯/肖慧