野生甘蒙錦雞兒的組織培養(yǎng)研究

趙培霞， 王 雷

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

甘蒙錦雞兒(CaraganaopulensKom.)是豆科錦雞兒屬植物，多年生灌木，高40～60 cm，主要分布于內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、寧夏、甘肅、青海東部、四川北部、西藏昌都地區(qū)，生長(zhǎng)于海拔高達(dá)3 400 m的干山坡、溝谷、丘陵[1-3]。甘蒙錦雞兒是干旱地區(qū)良好的水土保持樹種[4]，枝葉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量高，為優(yōu)良飼料；其莖干粗硬，耐燃燒，可做薪柴；是優(yōu)良綠肥植物[5]。

甘蒙錦雞兒是一種花色鮮艷、葉形美觀、抗旱性極強(qiáng)、適應(yīng)性比較廣的我國(guó)特有野生植物。隨著城市園林綠化建設(shè)的不斷發(fā)展，野生花卉的引種馴化和開發(fā)應(yīng)用越來越受到重視[6]。如果將鄉(xiāng)土植物引種到北方城市園林綠化建設(shè)中，可在層次、色彩感方面起到一定的作用。除在園林方面價(jià)值顯著外，藥用方面的價(jià)值也很顯著，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、降壓等多種藥理作用[7]。目前，肖岸容[8]、楊中鐸[9]等對(duì)甘蒙錦雞兒的優(yōu)良化學(xué)成分進(jìn)行了詳細(xì)的研究。冷肖荀[10]對(duì)甘蒙錦雞兒芽苗切根移栽容器育苗進(jìn)行了試驗(yàn)，指出使用IBA和ABT，可以極顯著地促進(jìn)側(cè)根數(shù)的增加。瞿元清[11]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甘蒙錦雞兒在荒山造林的成活率方面明顯較其他樹種高。馬成倉(cāng)[12]對(duì)內(nèi)蒙古高原地區(qū)的甘蒙錦雞兒的光合作用和水分代謝進(jìn)行研究。甘蒙錦雞兒多用種子繁殖，但甘蒙錦雞兒不僅果莢內(nèi)種子數(shù)量極少，而且種子害蟲嚴(yán)重，種子被害率很高。因此，依靠種子繁殖進(jìn)行資源擴(kuò)繁困難重重。錦雞兒屬其他種[13-15]在組培方面都有相關(guān)研究，而甘蒙錦雞兒在組培方向的研究還處于相對(duì)空白狀態(tài)。本試驗(yàn)擬利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，找到合適的激素搭配，培育出具有優(yōu)良性狀的植株，為甘蒙錦雞兒今后的引種及擴(kuò)大繁殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用的甘蒙錦雞兒成熟種子于學(xué)校指定種子公司購(gòu)買，置于4℃冰箱保存，選取籽粒飽滿的種子備用。

1.2 方法

1.2.1種子預(yù)處理與消毒 選取成熟飽滿的種子置于圓柱瓶中用蒸餾水浸泡一晚(種子硬度強(qiáng))，將浸泡后的種子置于超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精浸泡30 s，此濃度的酒精有很強(qiáng)的穿透力和殺菌力，但卻不能徹底滅菌[16]，用無菌水沖洗3～5次，再用2%的次氯酸鈉浸泡，浸泡時(shí)不停的搖晃瓶子，作6種梯度進(jìn)行滅菌：0，8，10，12，15，17 min，最后用無菌水沖洗3～5次，用濾紙吸干凈種子表面的水分，接種于MS(Murashige and Skoog medium，MS培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中，7 d統(tǒng)計(jì)污染率。

1.2.2種子萌發(fā) 在超凈臺(tái)中，將經(jīng)過不同滅菌時(shí)間處理的種子接種于以MS+3%蔗糖+0.6%瓊脂為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度的6-BA(6-Benzylaminopurine，6-芐氨基腺嘌呤)(0.2，0.5，1.0，1.5 mg·L-1)和NAA(α-Naphthalene acetic acid，α-萘乙酸)(0.05，0.1，0.3 mg·L-1)共12個(gè)組合，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接個(gè)2外植體，置于光培養(yǎng)，從接種之日起30 d觀察芽的萌發(fā)情況，并統(tǒng)計(jì)種子誘導(dǎo)率及萌發(fā)新芽的生長(zhǎng)狀況。

1.2.3芽的增殖 甘蒙錦雞兒的組培苗長(zhǎng)到一定高度時(shí)，剪取含有一對(duì)腋芽的莖段，接種于以MS+3%蔗糖+0.6%瓊脂為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度的6-BA(0.2，0.5，1.0 mg·L-1)和NAA(0.05，0.1，0.2 mg·L-1)。按照2因素3水平正交實(shí)驗(yàn)安排，共9種組合，選擇生長(zhǎng)良好的芽增殖繼代2～3次，繼代周期為30 d，并在4周左右觀察芽的增殖系數(shù)和植株生長(zhǎng)狀況。

1.2.4生根培養(yǎng) 將生長(zhǎng)良好的植株，移植于以1/2 MS+2%蔗糖+0.6%瓊脂為基本培養(yǎng)基，分別添加1)IBA(Indole-3-butyric acid，吲哚丁酸) 0.3 mg·L-1+ NAA 0.3 mg·L-1；2)IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1；3)IBA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.8 mg·L-1；4)IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)0.5 mg·L-1；5)IAA 0.5 mg·L-1+ GA3(Gibberellin，赤霉素) 0.15 mg·L-1；6)IAA 0.1 mg·L-1；7)IBA 0.3 mg·L-1；8)IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1的培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，30 d后觀察生根數(shù)，生根時(shí)間和試管苗的生長(zhǎng)狀況。

1.2.5煉苗與移栽 將經(jīng)生根培養(yǎng)的甘蒙錦雞兒幼苗移栽到已經(jīng)滅菌的草炭土∶珍珠巖∶蛭石=6∶3∶1的混合基質(zhì)中，前3 d密封處理，3 d后期間可揭少蓋通風(fēng)換氣，15 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.6培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基PH范圍為5.75～5.85，于121℃高壓滅菌鍋(1.1 Mpa)內(nèi)滅菌，后放于工作臺(tái)冷卻備用。接種后放于溫度為25±1℃，光照強(qiáng)度為50 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間為12 h的培養(yǎng)室。

1.2.7數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析處理。

數(shù)據(jù)采用以下公式進(jìn)行處理：

污染率(%)=被污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；

芽誘導(dǎo)率(%)=發(fā)生萌發(fā)個(gè)數(shù)/外植體總數(shù)×100%；

叢生芽誘導(dǎo)率(%)=長(zhǎng)叢生芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%；

增殖系數(shù)=形成叢生芽的總數(shù)/外植體總數(shù)；

生根率(%)=生根的外植體個(gè)數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子預(yù)處理與消毒

試驗(yàn)用種子含水率比較低，生理活動(dòng)非常微弱。故對(duì)種子進(jìn)行預(yù)處理，浸種于蒸餾水的目的是使種子較快地吸水，達(dá)到能正常發(fā)芽的含水量。外植體的消毒滅菌是組織培養(yǎng)的難點(diǎn)之一，因此確定合適的滅菌試劑和滅菌時(shí)間是極其重要的一步。試驗(yàn)所采用的外植體為成熟種子，材料消完毒后，將種子和藥劑接觸的種皮去除(種皮部分可能攜帶細(xì)菌)接種于MS培養(yǎng)基。接種7 d后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率和成活率見表1。污染率隨著滅菌時(shí)間的加長(zhǎng)而逐漸減小，褐化率也逐漸減小，但隨著滅菌時(shí)間的加長(zhǎng)，污染率、褐化率又逐漸加大，在15 min是污染率達(dá)到最小，種子出芽率為最高，而且種子生長(zhǎng)狀態(tài)比較好，如果滅菌時(shí)間過長(zhǎng)，使種子失去活性，嚴(yán)重影響種子的發(fā)芽率。因此，在甘蒙錦雞兒無菌苗體系建立過程中，采用75%酒精滅菌30 s配合次氯酸鈉消毒15 min為較為適宜的方法。

表1 不同方式對(duì)甘蒙錦雞兒種子滅菌效果的影響Table 1 Effect of different methods on seed disinfection of C. opulens

2.2 不同激素組合對(duì)初代培養(yǎng)的影響

將甘蒙錦雞兒的種子接于以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA和NAA組合的12種培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)過程見圖1。表2是甘蒙錦雞兒在各不同濃度激素處理下培養(yǎng)30 d后，種子的萌發(fā)率及新芽的生長(zhǎng)狀況。

圖1 甘蒙錦雞兒組織培養(yǎng)過程Fig.1 Process of tissue culture of C. opulens注：a：外植體；b-c：叢生芽誘導(dǎo)；d-f：生根植株；g-i：試管苗生根；j-l：煉苗Note:a:Explants;b-c:Cluster bud induction;d-f:Rooting plants;g-i:Rooting of test-tube plantlets;j-l:Training seedling

表2 不同激素濃度組合對(duì)甘蒙錦雞兒成熟胚芽誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different hormone concentration combinations on induction of mature embryo of C. opulens

處理Treatments編號(hào)Number激素濃度Hormone concentration/mg·L-16-BANAA種數(shù)Number of vaccinations誘導(dǎo)芽率Induced bud rate芽生長(zhǎng)情況Bud situation1G10.200.056048.62%±0.04++2G20.200.106050.84%±0.08++3G30.200.306036.67%±0.23+4G40.500.056078.84%±0.01++++5G50.500.106059.98%±0.19+++6G60.500.306043.67%±0.32++7G71.000.056062.60%±0.18+++8G81.000.106046.19%±0.05++9G91.000.306052.33%±0.26++10G101.500.056035.41%±0.06+11G111.500.106043.67%±0.08+12G121.500.306051.67%±0.56++

注：++++生長(zhǎng)非常，+++好，++一般、+不是很好

Note：+++ growth is very,+++ good,++ average,+ not very good

F檢驗(yàn)結(jié)果見表3：因素6-BA、NAA及兩者的交互作用對(duì)種子誘導(dǎo)效果產(chǎn)生顯著影響。6-BA、兩者的交互作用及NAA的F值從大到小依次為13.18，8.86和7.48。說明6-BA對(duì)種子的誘導(dǎo)率影響最大，兩者的交互作用次之，然后是NAA。要確定哪個(gè)水平影響效果顯著，則需進(jìn)行多重比較分析，采用Duncan方差分析見表4，5。

表3 誘導(dǎo)芽率的多因素方差分析Table 3 Multivariate variance analysis of induced bud rate

注：P<0.05.下同

Note:P<0.05. The same as below

從表4得出：在P<0.05水平下，6-BA在A2(0.5 mg·L-1)、A3(1.0 mg·L-1)水平時(shí)與其他2個(gè)濃度水平A1、A4呈現(xiàn)顯著性差異，A2與A3水平間差異不顯著、A1與A4水平間差異不顯著；在P<0.01水平下，6-BA在A2、A3水平時(shí)與其他2個(gè)濃度水平A1、A4呈現(xiàn)極顯著性差異，A2與A3、A1與A4水平間差異不顯著；根據(jù)均值大小，即當(dāng)6-BA為A2(0.5 mg·L-1)水平時(shí)對(duì)誘導(dǎo)芽率影響最顯著。

表4 A因素(6-BA)4水平Duncan檢驗(yàn)Table4 Duncan test of factor A(6-BA) on 4 levels

注：不同小寫字母表示0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示0.01水平差異顯著，下同

Note:Different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level,and different uppercase letters indicate significant differences at the 0.01 level,The same as below[17]

從表5得出：在P<0.05水平下，NAA在B1(0.05 mg·L-1)水平時(shí)與B2，B3水平呈現(xiàn)顯著性差異，B2與B3水平間差異不顯著；在P<0.01水平下，NAA在B1水平時(shí)與B3呈現(xiàn)極顯著性差異，B1與B2，B2與B3水平間差異不顯著，即誘導(dǎo)率最高時(shí)為NAA的B1(0.05 mg·L-1)水平。綜上所述，甘蒙錦雞兒成熟種子初代培養(yǎng)的適宜濃度組合為6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1，誘導(dǎo)率最高為78.84%。

表5 B因素(NAA)3水平Duncan檢驗(yàn)Table5 Duncan test of factor B(NAA) on 3 levels

2.3 不同濃度激素配比對(duì)芽繼代增殖的影響

試驗(yàn)采用2因素3水平正交設(shè)計(jì)，在添加不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA的9種培養(yǎng)基中進(jìn)行單芽繼代增殖影響的試驗(yàn)，甘蒙錦雞兒的實(shí)生苗長(zhǎng)到一定高度時(shí)，將其莖剪下，并將莖切成小段進(jìn)行接種，幾天后基部開始膨脹產(chǎn)生愈傷組織，莖段上部在生長(zhǎng)的同時(shí)產(chǎn)生從生芽。表6是30 d的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

為了對(duì)比2種因素各濃度水平對(duì)芽增殖的影響進(jìn)行極差分析，從極差值R直觀可知，NAA對(duì)增殖系數(shù)的影響最大，其次是6-BA，優(yōu)選水平后，確定A2B1的增殖效果最好，即6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1，增殖系數(shù)最高為3.30(見圖1-b，c)，在該培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后，一年可以實(shí)現(xiàn)3.311≈510 000棵具有相同優(yōu)良性狀的植株，通過這種方式可以實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)繁的目的。

表6 不同激素組合對(duì)甘蒙錦雞兒不定芽繼代芽增殖的影響Table 6 Effects of different hormone combinations on increment of adventitious buds of C. opulens

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析如表7所示，6-BA、NAA及兩者的交互作用對(duì)芽增殖效果產(chǎn)生顯著影響。兩者的交互作用、NAA、6-BA的F值從大到小依次為10.21,6.67和6.39，說明兩者的交互作用對(duì)繼代增殖產(chǎn)生叢生芽的影響最大，NAA次之，然后是6-BA。為確定最佳激素組合，需進(jìn)一步進(jìn)行Duncan分析。

表7 芽增殖率的多因素方差分析Table 7 Multivariate variance analysis of bud proliferation rate

從表8得出：在P<0.05水平下，6-BA在A2(0.5 mg·L-1)、A3(1.0 mg·L-1)水平時(shí)與A1呈現(xiàn)顯著性差異，A2與A3水平間差異不顯著，在P<0.01水平下，6-BA在A2、A3水平時(shí)與A1呈現(xiàn)極顯著性差異，A2與A3水平間差異不顯著，故根據(jù)均值大小，6-BA為A2(0.5 mg·L-1)水平時(shí)對(duì)增殖率影響最顯著。

表8 A因素(6-BA)3水平Duncan檢驗(yàn)Table8 Duncan test of factor A(6-BA) on 3 levels

從表9得出：在P<0.05水平下，NAA在B1(0.05 mg·L-1)水平時(shí)與B2、B3水平呈現(xiàn)顯著性差異，B2與B3水平間差異不顯著；在P<0.01水平下，NAA在B1水平時(shí)與B3呈現(xiàn)極顯著性差異，B1與B2水平間差異不顯著、B2與B3水平間差異不顯著，即NAA為B1(0.05 mg·L-1)時(shí)增殖率最高。綜上所述，適宜增殖的濃度組合為6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.05mg·L-1，與極差分析結(jié)果一致。

表9 B因素(NAA)3水平Duncan檢驗(yàn)Table 9 Duncan test of factor B(NAA) on 3 levels

2.4 不同濃度激素配比對(duì)芽生根的影響

在所設(shè)計(jì)的8種生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn)，均有不同程度的生根(見表10、圖1-g，h，i)。添加激素IAA的培養(yǎng)基生根效果要好于添加激素IBA的培養(yǎng)基的生根效果，生根時(shí)間短，生根率高，根數(shù)量多，植株健壯。在只添加IAA的培養(yǎng)基中，隨著IAA濃度的增加生根率逐漸下降，高濃度激素對(duì)生根產(chǎn)生一定的抑制作用，但是當(dāng)IAA濃度同為0.5 mg·L-1時(shí)，配合添加GA 0.15 mg·L-1時(shí)，生根率有所增加。隨著IBA濃度的增加生根率無明顯變化。S2與S1相比、S4與S3相比，IBA濃度不變，NAA濃度增加，生根率也明顯增加但是生根時(shí)間明顯加長(zhǎng)，其原因主要是NAA濃度增加在切口處形成大量愈傷組織，延長(zhǎng)了生根的時(shí)間。

接種培養(yǎng)30 d統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn):在S7:1/2 MS + IAA 0.5 mg·L-1+ GA 0.15 mg·L-1和S8:1/2 MS + IAA 0.1 mg·L-1兩種培養(yǎng)基上生根率都較高，但是在S7中生根大多數(shù)為單根，綜合考慮S8：1/2 MS + IAA 0.1 mg·L-1這一培養(yǎng)基上的培養(yǎng)效果最好生長(zhǎng)旺盛，植株高大，葉色深綠(如圖1-f)，主根明顯(如圖1-g)，根系發(fā)達(dá)，其平均生根率為63.16%，平均生根數(shù)為2.17條·株-1，平均株高5.5 cm。

2.5 煉苗與移栽

將生根的甘蒙錦雞兒取出，用水洗掉殘余培養(yǎng)基，移栽到草炭土∶珍珠巖∶蛭石=6∶3∶1的混合基質(zhì)中，7天后統(tǒng)計(jì)成活率為90%，并且植株健壯(見圖1-j，k，l)。

3 討論

組培試驗(yàn)中面臨的最大問題是外植體極易受感染，因此，在試驗(yàn)各個(gè)步驟中都應(yīng)該謹(jǐn)慎。試驗(yàn)過程中，滅菌不充分，工作臺(tái)中有菌等都是感染的誘因，導(dǎo)致后期試驗(yàn)無法進(jìn)行。甘蒙錦雞兒種子病蟲害較多，在滅菌過程中無法消除干凈，對(duì)后期感染率有一定影響。目前來看，甘蒙錦雞兒種子的滅菌以15 min最為適宜，種子的感染率最小，如果加長(zhǎng)滅菌時(shí)間，種子活性下降。錦雞兒屬植物種子病蟲害較多，影響種子發(fā)芽率，種子存儲(chǔ)時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)芽率和萌發(fā)速度都大大降低[18]，因此在選擇種子的時(shí)候應(yīng)選擇當(dāng)年生的進(jìn)行組織培養(yǎng)最好，萌發(fā)的植株生長(zhǎng)狀況良好，更有益于后期的繼代增殖。

試驗(yàn)選擇成熟種子為外植體萌發(fā)切取莖段誘導(dǎo)分化苗，沒有經(jīng)過愈傷組織的誘導(dǎo)及分化，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)流程，極大程度上縮短了時(shí)間，此種方法培養(yǎng)的組培苗可以穩(wěn)定地保持母體的優(yōu)良特性[19]。

在組培試驗(yàn)中，激素種類以及濃度組合錯(cuò)綜復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)對(duì)增殖方案的優(yōu)化，避免了單因素的局限性，發(fā)揮了正交設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)：即用最少的處理得到最佳的組合；另一方面可以確定組織培養(yǎng)各個(gè)階段的關(guān)鍵因素[17]。成熟胚的組織培養(yǎng)研究比較少，沈海龍[20-21]是利用未成熟胚進(jìn)行組織培養(yǎng)，本試驗(yàn)所用材料為甘蒙錦雞兒成熟胚。在增殖方面，增殖系數(shù)不是特別理想，后期可以尋找更合適的激素配比使得誘導(dǎo)芽增殖系數(shù)更大。在植物根系的誘導(dǎo)過程中，根系的生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要來源于激素，不同激素配比對(duì)植物的作用明顯不同。甘蒙錦雞兒在生根方面，大多數(shù)植物使用IBA[22-23]，但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用IAA生根效果好，生根時(shí)間短，與武春燕試驗(yàn)結(jié)果相同[24]。目前關(guān)于甘蒙錦雞兒組培方面研究暫處于相對(duì)空白狀態(tài)，對(duì)后期的研究有參考價(jià)值。

4 結(jié)論

試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行甘蒙錦雞兒的組織培養(yǎng)時(shí)，其種子的滅菌以75%酒精滅菌30 s加氯酸鈉滅菌15 min最為適宜，存活率高；種子萌發(fā)培養(yǎng)基以MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1最佳，誘導(dǎo)率最高為78.84%；增殖培養(yǎng)基以MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1最佳，增殖系數(shù)為3.30；以1/2 MS + IAA 0.1 mg·L-1生根效果最好，植株健壯；將生根的植株移栽到草炭土∶珍珠巖∶蛭石=6∶3∶1的混合基質(zhì)中，成活率為90%；本研究最終建立了一套野生甘蒙錦雞兒的組培體系，為以后野生甘蒙錦雞兒引種到城市園林建設(shè)中提供一定的借鑒作用。