1株鴨坦布蘇病毒的分離鑒定及產(chǎn)蛋鴨發(fā)病模型的建立

姚 蓉 康 超 鄒 忠 徐巧霞 孫小美 孫小云 金梅林,

1.武漢科前生物股份有限公司，武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢430070

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（duck tem?busu virus，DTMUV）感染鴨引起的，是2010年以來在我國主要蛋鴨養(yǎng)殖區(qū)陸續(xù)暴發(fā)的一種急性傳染病，以蛋鴨、種鴨產(chǎn)蛋驟然下降為主要臨床特征，以出血性卵巢炎為主要病變特征［1］。商品肉鴨和育成期的種鴨可在20日齡前發(fā)病，表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀，腿腳麻痹、站立不穩(wěn)，病鴨大多數(shù)因飲水、采食困難衰竭死亡，若發(fā)生細(xì)菌繼發(fā)感染則死淘率會(huì)增加［2］。鴨坦布蘇病毒病的暴發(fā)流行給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害了我國養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展［3-5］。加強(qiáng)對DTMUV的分離鑒定及發(fā)病模型的建立，不僅能對該病進(jìn)行監(jiān)測及防控，也能為鴨坦布蘇病毒病疫苗的研制和疫苗的效力檢驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)［6-7］。

本研究室采集了湖北某鴨場蛋鴨的卵巢病變組織，組織經(jīng)研磨處理后，經(jīng)RT-PCR 鑒定，結(jié)果為鴨坦布蘇病毒陽性。將組織處理液在SPF雞胚上連續(xù)傳代，成功分離鑒定出1 株DTMUV，命名為DT?MUV-DF2 株。通過將DTMUV-DF2 株感染成年鴨建立動(dòng)物感染模型，結(jié)果病毒感染1～3 d，有感染鴨血清中病毒分離率均為100%；病毒感染后卵泡出現(xiàn)變形、破裂或出血等變化，感染后5～10 d 卵巢病變率較高，8～10 d 病變率均為100%。對以上統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最終確定了該病毒對產(chǎn)蛋鴨的發(fā)病模型。

1 材料與方法

1.1 雞胚與試驗(yàn)動(dòng)物

6日齡SPF 雞胚和8～10日齡SPF 雞胚均購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

25～40周齡鴨坦布病毒抗體陰性健康易感麻鴨購自湖北隆興湖蛋鴨養(yǎng)殖股份有限公司。

1.2 主要試劑

病毒基因組提取試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNase Inhibitor 和DNA Marker DL-2000 均購自寶生物工程（大連）有限公司；dNTP Mixture 購自羅氏公司；TransTaq -T DNA Polymerase 購自全式金生物；青鏈霉素混合液（100×）購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自上海生工生物技術(shù)有限公司。鴨坦布蘇病毒的鑒定引物序列為NS5-F:5′-GGGGAGGTG?GTTTGGTTAG-3′；NS5-R:5′-GTTCTGGGGCTTTG?GTATC-3′，擴(kuò)增片段大小為498bp［8-9］。

1.3 樣品的采集和處理

無菌采集病死鴨病變卵巢，剪碎勻漿后按1∶4（v/v）的比例加入滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS），反復(fù)凍融3 次后，12 000 r/min 離心5 min，取上清加入青鏈霉素，使終濃度均為10 000 單位/mL，4 ℃作用2 h。用0.22μm的濾器過濾除菌，濾過液置-70 ℃以下保存?zhèn)溆茫?0］。

1.4 樣品的RT-PCR鑒定

取經(jīng)處理的病料濾過液300μL 至1.5 mL EP 管中，參照病毒基因組提取試劑盒提取病毒RNA，最后用20 μL DEPC 水溶解。反轉(zhuǎn)錄按AMV Reverse Transcriptase說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系cDNA 2μL，10×Trans Buffer 2.5 μL，TransTaq DNA Polymerase 0.5μL，上、下游引物各1μL，補(bǔ)H2O 至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃變性5 min 后進(jìn)行94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s 的30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，保存于4 ℃。PCR 產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若擴(kuò)增出498 bp 片段大小則說明RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性［10］。

1.5 病毒分離

將RT-PCR檢測為陽性的病料懸液經(jīng)尿囊腔接種5 枚8日齡SPF 雞胚，0.2 mL/胚，每日觀察，棄去24 h 內(nèi)死亡胚，24～96 h 死亡雞胚隨時(shí)收獲，96 h 后將未死亡雞胚置4 ℃，且于12 h后收集雞胚尿囊液。對收獲的雞胚尿囊液進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，若為陽性則置-70 ℃以下保存?zhèn)溆?，若為陰性則進(jìn)行盲傳，盲傳7代后仍為陰性者棄去。

1.6 病毒含量測定（雞胚半數(shù)致死量ELD50）

將病毒懸液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-64個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度經(jīng)卵黃囊接種6日齡SPF雞胚各5枚，每胚0.1 mL，置濕度60%～65%、溫度37 ℃繼續(xù)孵育。逐日照胚并記錄結(jié)果，24 h內(nèi)死亡雞胚不計(jì)，統(tǒng)計(jì)24 h后死胚數(shù)量，一般需要觀察5 d；結(jié)果的計(jì)算按Reed-Muench法進(jìn)行計(jì)算［11］。

1.7 動(dòng)物發(fā)病模型的研究

1）病毒血癥的研究。將25～40周齡成年蛋鴨隨機(jī)分成10組，10只/組，每只鴨經(jīng)腿部肌肉接種鴨坦布蘇病毒（DF2株）雞胚毒，每只0.5 mL（病毒含量為105ELD50）。攻毒后第1～10日，每日隨機(jī)選取一組，經(jīng)翅靜脈采血后分離血清，每份血清卵黃囊接種5枚6日齡SPF雞胚，每胚0.1 mL。接種后置37 ℃溫箱繼續(xù)孵化，24 h內(nèi)死亡雞胚棄去，統(tǒng)計(jì)24～120 h雞胚死亡情況，5枚雞胚至少有4 枚雞胚死亡，則判定這份血清病毒分離為陽性［12-13］。

2）卵泡病理變化。每日對采血后的鴨進(jìn)行剖殺，觀察并記錄卵泡是否有破裂、出血、變形或壞死等病理變化。統(tǒng)計(jì)每日卵泡病變比例，摸索鴨坦布蘇病毒引起的卵泡病變規(guī)律。結(jié)合病毒分離情況及卵巢病變情況，分析卵巢的病變特征，依據(jù)病毒分離及卵泡病變情況確定發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離及鑒定結(jié)果

對采集的樣品進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，從3份樣品中擴(kuò)增出了特異性片段，大小為498 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。將RT-PCR 檢測為陽性的病料懸液經(jīng)尿囊腔接種5枚8日齡SPF 雞胚，對收獲的雞胚尿囊液進(jìn)行RTPCR 擴(kuò)增，結(jié)果在盲傳3 代后RT-PCR 擴(kuò)增為陽性，記為F1代。在雞胚上連續(xù)傳代至F5代，RT-PCR擴(kuò)增均為陽性（圖2），將獲得的病毒液命名為DF2 株（登錄號(hào)為KJ489355.1）。

圖1 病料RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 分離株RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 病毒在雞胚上的傳代與含量測定

將獲得的DF2 株病毒液在SPF 雞胚上連續(xù)傳代，一直到第10 代，結(jié)果每一代病毒液的RT-PCR均為陽性，測定各代次病毒液的病毒含量ELD50，結(jié)果DF2 株病毒在傳到第5 代時(shí)病毒滴度上升到104.5ELD50/mL，在第10 代達(dá)到105.0ELD50/mL，說明DF2株在雞胚上的增殖能力較強(qiáng)（表1）。

表1 DF2分離株在SPF雞胚上的增殖滴度（ELD50/mL）

2.3 動(dòng)物發(fā)病模型結(jié)果

1）病毒分離。鴨只經(jīng)病毒感染后前3 d病毒分離陽性率均為100%，從第4天開始病毒分離陽性率開始下降，自第6 天開始，血清病毒分離均轉(zhuǎn)為陰性（表2）。

表2 感染鴨病毒分離情況

2）卵泡病變情況。鴨只經(jīng)病毒感染后，每日對已采血的鴨只進(jìn)行剖殺，結(jié)果，有13只鴨無大的卵泡，卵泡直徑均＜1 cm，說明卵泡發(fā)育處于靜止期，無法判斷病毒感染對卵泡發(fā)育的影響，所以卵巢檢查應(yīng)剔除卵泡發(fā)育處于靜止期的鴨［14］。其余87 只鴨卵泡處于生長期，病毒感染后第2日卵泡開始出現(xiàn)破裂、變形、出血或壞死，第5～10 天卵泡病變率較高。對第5～10 天的卵泡病變類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果25.5%（14/55）卵泡破裂、96.4%（53/55）卵泡變形、38.2%（21/55）卵泡壞死（圖3）。詳細(xì)結(jié)果見表3。

圖3 卵泡病變情況

表3 卵泡病變統(tǒng)計(jì)情況

3）發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)的確定。由于產(chǎn)蛋母鴨卵巢發(fā)育存在個(gè)體差異（卵泡大小、卵泡數(shù)量），我們在制定發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)對這些情況進(jìn)行了區(qū)分，以便于更客觀的評價(jià)感染情況。①存在個(gè)別母鴨產(chǎn)蛋暫時(shí)處于靜止期的生理狀態(tài)，此時(shí)的卵泡直徑均小于1 cm，卵泡病變情況不易判斷，所以我們在制定卵巢的病變情況時(shí)設(shè)定了卵泡直徑大于1 cm 的判定條件。②當(dāng)母鴨產(chǎn)蛋旺盛時(shí)卵泡數(shù)量過多，在試驗(yàn)操作過程中會(huì)引起個(gè)別卵泡非特異性出血，為了更客觀地判定攻毒鴨的發(fā)病情況，我們在制定發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)對此種情況規(guī)定為當(dāng)卵泡數(shù)＞3 時(shí)，變性和壞死卵泡數(shù)≥3 判為卵巢病變。③當(dāng)母鴨卵泡數(shù)偏少時(shí)無相應(yīng)的因擠壓等引起的卵泡非特異性出血，我們在制定發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)對此種情況規(guī)定為當(dāng)卵泡數(shù)≤3 時(shí)，變性和壞死卵泡數(shù)≥1 判為卵巢病變［14］。

綜合以上卵泡病變情況以及病毒血癥規(guī)律，我們確定了鴨坦布蘇病毒感染鴨的發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)如下，攻毒后第3日采血分離血清，每份血清卵黃囊接種5枚6日齡SPF 雞胚，0.1 mL/枚，置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，持續(xù)觀察5 d，24 h內(nèi)死亡雞胚不計(jì)，如接種雞胚中有4 枚及以上死亡，則判為病毒分離陽性。病變卵巢的判定：卵泡數(shù)＞3 個(gè)時(shí)，變形、出血或壞死卵泡數(shù)＞2 個(gè)，卵泡數(shù)≤3 個(gè)時(shí)，有變形、出血或壞死卵泡。卵巢發(fā)育成熟期的鴨，病毒分離和卵巢病變均為陽性則判發(fā)病。

3 討 論

2010年以來我國大部分種鴨和蛋鴨養(yǎng)殖地區(qū)相繼發(fā)生了以減料、產(chǎn)蛋下降和伴有一定死淘率為特征的傳染病，該病發(fā)病急，傳播快，死淘率高［15］。該病能引起蛋鴨產(chǎn)蛋率驟降、肉鴨發(fā)育遲緩甚至死亡，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自該病暴發(fā)以來，迅速蔓延至我國大部分鴨養(yǎng)殖地區(qū)以及臨近的東南亞地區(qū)。DTMUV 宿主范圍廣泛，除了感染鴨、鵝等水禽和雞、麻雀等其他禽類外，也可以感染哺乳動(dòng)物，具有潛在的公共衛(wèi)生安全風(fēng)險(xiǎn)［16］。

在本研究中，本研究室從疑似感染鴨坦布蘇病毒的病鴨組織中分離到1 株鴨坦布蘇病毒，在SPF雞胚上增殖穩(wěn)定后，對產(chǎn)蛋麻鴨進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)，摸索鴨坦布蘇病毒病的發(fā)病情況。在此基礎(chǔ)之上，我們建立了一種鴨坦布蘇病毒病在產(chǎn)蛋鴨上的動(dòng)物模型，并確定了其發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)，這不僅能在鴨坦布蘇病毒病疫苗的研制過程中提供疫苗的效力檢驗(yàn)評判標(biāo)準(zhǔn)，也為該病的臨床診斷提供了依據(jù)，能有效監(jiān)測和防控鴨坦布蘇病毒病的流行和蔓延［17］。