不同植物精油體外抑菌效果的研究

摘 要：植物精油是一種天然綠色活性物質(zhì)，具有很好的抑菌效果，其在飼料中應(yīng)用具有廣闊開發(fā)前景。本文采用瓊脂平板孔洞法分別對不同來源的肉桂醛、香芹酚等植物精油及其混合物進(jìn)行體外抑菌效果篩選和評估。結(jié)果表明，香芹酚、肉桂醛、百里香酚和丁香酚對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等常見動物消化道內(nèi)有害菌有很好的抑菌效果，其抑菌順序?yàn)槿夤鹑?gt;香芹酚>丁香酚>百里香酚，用棕櫚油進(jìn)行1：4比例稀釋后，精油的抑菌效果均有不同程度的下降。由4種精油組成的復(fù)方產(chǎn)品對大腸桿菌等腸道有害菌有較好的抑制作用，且熱穩(wěn)定性好。結(jié)論：肉桂等植物精油對常見有害菌具有良好的抑菌效果，可作為天然的抑菌劑。

關(guān)鍵詞：植物精油；肉桂醛；香芹酚；抑菌效果

中圖分類號：S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號：1001-0769（2014）04-0050-03

植物精油（Essential Oil，EO）是植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)，一般以植物的花、葉、枝、根、皮、樹膠、全草和果實(shí)等為原料，通過蒸汽蒸餾、壓榨等方式方法萃取出的植物揮發(fā)性芳香物質(zhì)（Casamiglia，2007）。近年來大量的研究發(fā)現(xiàn)從香辛料等植物中提取的植物精油具有很好的抗真菌、細(xì)菌及其它微生物的活性（Friedman，2004）。天然植物精油作為天然飼料防腐劑和胃腸道微生物的調(diào)控劑已成為目前的研發(fā)熱點(diǎn)。本文根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)資料選擇含有抗菌活性的肉桂醛（Singh，2007）、丁香酚（呂世明，2008）、香芹酚和百里香酚（胡艷芬，2010）等植物精油，比較不同來源及不同稀釋濃度下精油對常見有害菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等的抑菌效果，為實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料：市場上出售的不同廠家的含有肉桂醛、香芹酚、百里香酚和丁香酚的精油及原料，棕櫚油、載體、瓊脂糖培養(yǎng)基（MHA）。

儀器：電子天平（感量0.0 001 g）、培養(yǎng)皿、試管、移液槍、接種環(huán)、立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安科學(xué)儀器廠）、LRH系列生化培養(yǎng)箱（上海一恒儀器廠）、生物安全柜、標(biāo)尺等。

試驗(yàn)菌種：大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、乳酸桿菌（ Lactobacillus），以上菌種均由安佑集團(tuán)研究院微生物研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單方精油抑菌試驗(yàn)

先對市場上各種精油原料進(jìn)行抑菌篩選，確定抑菌效果較好的原料。再采用無抑菌效果的棕櫚油對目標(biāo)精油進(jìn)行1：4比例的稀釋，觀測其抑菌效果的變化。

1.2.2 復(fù)方精油抑菌試驗(yàn)

根據(jù)1.2.1的試驗(yàn)結(jié)果，對4種精油進(jìn)行定比例復(fù)方配制，制成成品后，測定熱處理前后復(fù)方精油的抑菌效果。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品制備

精油稀釋樣品：準(zhǔn)確稱取10 g食品級香芹酚至棕色玻璃瓶中，加入到40 g植物油，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆?，密封低溫保存，待用。同樣方法制備肉桂醛、丁香酚和百里香酚的稀釋樣?/p>

復(fù)方精油產(chǎn)品：按綜合配方定量稱取植物精油，依次加入到植物油中，充分?jǐn)嚢韬蠹尤胼d體中即得樣品。

復(fù)方精油產(chǎn)品熱穩(wěn)定試驗(yàn)處理：將制備的復(fù)方精油樣品置于40 ℃烘箱中進(jìn)行加熱處理，定期采樣，并進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，檢測抑菌效果的變化情況。

1.3.2 抑菌試驗(yàn)

1.3.2.1 應(yīng)用菌懸液的制備

參照文獻(xiàn)（Castillejos，2006）進(jìn)行菌懸液的制備。具體操作如下：取大腸埃希氏菌等的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在35～37 ℃培養(yǎng)7 d后。用滅菌水將菌落洗下，在56 ℃下加熱30 min。再用生理鹽水把制備好的菌懸液以10倍比稀釋成不同濃度，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，保持各菌懸液的濃度約為1×106 cfu/mL。

1.3.2.2 檢測平板的制備

取培養(yǎng)好的五種菌液1 mL加入到15 mL 50 ℃ MHA培養(yǎng)基，然后傾注滅菌平板。轉(zhuǎn)動平板使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，置于水平臺面，待其凝固。

1.3.2.3 檢測方法

對于液體精油，用內(nèi)徑5 mm的打孔器在完全凝固的含菌平板上打孔，用滅菌牙簽挑出孔中的培養(yǎng)基，然后在酒精燈火焰上封底。每孔中加入70 mL的植物精油的液體樣品。對于固體樣品，則稱取樣品0.01 g，均勻撒在含菌培養(yǎng)基平板表面直徑6 mm范圍內(nèi)，每個(gè)樣品做2個(gè)平行。將處理后的培養(yǎng)基平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，觀測抑菌圈的大小情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果以其平均值表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同精油產(chǎn)品的抑菌作用

對所有搜集的精油樣品進(jìn)行抑菌效果的試驗(yàn)結(jié)果見表1。牛至油的主要成分為香芹酚和少量的百里香酚，其表現(xiàn)出較好的抑菌效果，但不同來源的產(chǎn)品之間抑菌效果差異較大，其中對大腸桿菌的抑菌圈在2.40～2.95 cm之間，對沙門氏菌的抑菌圈在3.20～3.85 cm之間，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈在1.50～ 2.10 cm，對有益菌枯草芽孢桿菌的抑菌圈在3.00～3.15 cm之間，對乳酸菌抑制作用較弱。

肉桂植物提取的肉桂油、桂皮油和化工合成的食品級肉桂醛對腸道有害菌均表現(xiàn)出很好的抑菌效果，對大腸桿菌的抑菌效果在2.25～3.00 cm之間，對沙門氏菌的效果更好，抑菌圈在3.15～4.70 cm之間，除個(gè)別廠家的桂葉油和肉桂油可抑制金色葡萄球菌外，其他肉桂醛和桂皮油均無明顯抑制效果。且含肉桂醛的精油對有益菌乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌效果，其中對枯草芽孢桿菌的抑菌圈在3.25～3.85 cm之間，對植物乳酸桿菌的抑菌圈在2.30 cm以內(nèi)，個(gè)別肉桂醛則對乳酸菌則沒有抑菌效果。

此外，丁香酚和丁香香精對沙門氏菌、沙門氏菌、金色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌也表現(xiàn)出抑菌效果，二者差異顯著，丁香酚的抑菌效果接近丁香香精的1.44～2.27倍。百里香酚和百里香精之間的抑菌效果差異顯著，百里香酚除對大腸桿菌和沙門氏菌具有較好的抑菌效果外，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌也同樣具有較好的抑菌效果。這說明香精在抑菌方面效果劣于精油，其用途更偏重于氣味方面?？傮w來講精油對于各種有害菌的抑菌效果為：肉桂醛>香芹酚>丁香酚>百里香酚。

2.2 精油稀釋后抑菌作用

根據(jù)單方精油篩選的試驗(yàn)結(jié)果，對抑菌效果較好的食品級精油1：4的稀釋，觀測其抑菌效果的變化。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，稀釋劑棕櫚油對有害菌無抑制效果，故不干擾各試驗(yàn)組抑菌結(jié)果。肉桂醛在1：4稀釋后仍然具有較好的抑菌效果，丁香酚、香芹酚及百里香酚進(jìn)行1：4稀釋后，抑菌效果下降，特別是香芹酚和百里香酚下降更為明顯，其中香芹酚對大腸桿菌、沙門氏菌和金色葡萄球菌的抑菌效果分別下降54.67 %、 58.73 %和53.84 %。一方面這可能與其本身抑菌效果較弱有關(guān)。另一方面香芹酚在棕櫚油中的擴(kuò)散性可能較差，從而影響其抑菌效果。

按照一定比例混合而成的復(fù)方精油原樣及其稀釋樣對枯草芽孢桿菌的抑制效果差異較大，對其他菌種的抑菌效果差異不顯著。原因在于混合精油中肉桂醛所占比例較大，其抑菌效果主要由肉桂醛體現(xiàn)。

2.3 復(fù)方精油產(chǎn)品的抑菌作用

本試驗(yàn)制得的復(fù)方精油產(chǎn)品為乳白色細(xì)粉顆粒，具有肉桂等精油特有的辛香氣味，其流散性良好。

抑菌試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，自制復(fù)方精油產(chǎn)品在有大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基上產(chǎn)生清晰的抑菌圈，其表現(xiàn)出良好的抑菌效果，見圖1。

在40 ℃條件下，不同熱處理時(shí)間對自制復(fù)方精油產(chǎn)品抑菌效果的影響見表3。結(jié)果顯示，本復(fù)方精油產(chǎn)品具有較好的熱穩(wěn)定性，在熱處理24 h內(nèi)，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果沒有明顯影響，而對于沙門氏菌的抑制作用有小幅度的下降，但總體差異并不顯著。精油本身具有很強(qiáng)的揮發(fā)性，而本試驗(yàn)證實(shí)該精油產(chǎn)品熱穩(wěn)定性較好，其原因在于加入的棕櫚油可一定程度上減緩精油有效成分的揮發(fā)，從而保證了產(chǎn)品的抑菌、殺菌功效。

3 討論

一般認(rèn)為植物精油是安全的物質(zhì)。目前，植物精油已廣泛用于醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)。其作為天然高效的抑菌物質(zhì)對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有很強(qiáng)是殺滅作用（Castillejos，2006）。因此，精油類產(chǎn)品作為抗生素的潛在替代品成為研究的熱點(diǎn)。

胡艷芬（2010）等研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及豬霍亂沙門氏菌等常見病原菌有很好的抑制和殺滅作用，但同時(shí)也一定程度上抑制了植物乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌等腸道有益菌。這與本試驗(yàn)抑菌結(jié)果一致。百里香酚和香芹酚具有很強(qiáng)烈的辛香香氣，對動物有很好的誘食作用，且其同樣具有很好的殺菌效果（張靜，2009），其中丁香酚具有廣譜抗菌性，特別是對大腸桿菌抑制效果最為明顯。

存在于肉桂類植物精油中的肉桂醛對許多食品腐敗微生物同樣具有較好的抑制作用（王新偉，2010）。本試驗(yàn)中含有肉桂醛的精油對腸道中有害微生物均表現(xiàn)出很好的抑制效果，特別是純天然提取的肉桂精油的抑菌效果更好。原因在于精油起抗菌作用的是其所有成分中的一種或幾種，而天然提取的肉桂油中除了具有肉桂醛外，還具有乙酸肉桂酯、水楊醛等（楊繼章，2011），其作用效果略好于單純的肉桂醛精油。

精油的抑菌活性與其成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，一般醛類的抗真菌活性最高，其次為酚。此外，醇類，醚類和烴類物質(zhì)也具有一定的抑菌活性（陳麗艷，2006；邵海，2008）。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)不同精油對腸道有害菌的抑制作用為：肉桂醛>香芹酚>丁香酚>百里香酚。對有益菌乳酸桿菌抑菌效果較弱，對枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑制效果。

植物精油的抑菌機(jī)理因活性成分的不同而有所差異，但通常認(rèn)為其機(jī)理是精油中活性成分酚類、醇類物質(zhì)進(jìn)攻微生物的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁，影響細(xì)胞膜脂質(zhì)層的流動性，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，最終引起細(xì)菌生長受到抑制甚至導(dǎo)致死亡。電鏡掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)用肉桂醛、牛至油等精油作用的有害微生物菌絲體形態(tài)出現(xiàn)扭曲、裂解、變扁和變細(xì)的現(xiàn)象，部分精油成分還會影響細(xì)胞膜結(jié)果，抑制相關(guān)酶活，干擾生物活性物質(zhì)和核酸的合成，最終導(dǎo)致有害微生物生長受限甚至造成死亡（張寬朝，2011；呂飛，2011）。此外，香芹酚（Dipsaua，2006）可使枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜中脂肪酸的比例和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而降低其細(xì)胞膜的流動性。肉桂精油中的有效成分肉桂醛可與膜蛋白反應(yīng)，造成蛋白質(zhì)的凝結(jié)從而抑制產(chǎn)氣腸桿菌的氨基酸代謝（Wendakoon，1995）。丁香酚是通過使細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)變性、與細(xì)胞膜上的磷脂發(fā)生反應(yīng)，破壞膜的通透性，干擾蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁的合成，從而抑制微生物的生長（Maria，1998）。

因此推測本試驗(yàn)所篩選的香芹酚、肉桂醛、丁香酚等植物精油通過以上作用方式，破壞大腸桿菌等有害微生物的菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，干擾其生物學(xué)功能的發(fā)揮而產(chǎn)生抑菌、殺菌的效果。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，香芹酚、肉桂醛、百里香酚和丁香酚對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等常見動物消化道內(nèi)有害菌有很好的抑菌效果，由其配制的復(fù)方精油產(chǎn)品對有害菌同樣具有較好的抑制作用，且熱穩(wěn)定性較好。因此，植物精油作為天然的抑菌殺菌劑應(yīng)用到食品、飼料中具有良好的開發(fā)前景。

參考文獻(xiàn)：（16篇，略）