豬偽狂犬病毒原陽株gE全基因的克隆與序列分析

摘要：根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的豬偽狂犬病病毒（PRV）gE全基因序列，設(shè)計合成了1對引物，利用PCR技術(shù)對豬偽狂犬病河南原陽病毒株相關(guān)的毒力基因gE進行了擴增，將特異性DNA條帶進行回收，回收的PCR產(chǎn)物克隆到pMD?18-T載體中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。運用藍白斑篩選，挑取陽性菌落，提取重組質(zhì)粒進行PCR、酶切和測序鑒定。測序結(jié)果表明，該序列全長為 1 862 bp，將該基因核苷酸序列與從GenBank下載讀取的馬來西亞株（FJ176390）、愛爾蘭Nia-1株（FJ605136）、湖北Ea株、韓國株（AY249861）、美國Becker株（AY368490）、廣東SH株（EF552427）、西班牙株（EU502923）、河南焦作株（EU561349）等的gE基因進行同源性分析比較，得出的核苷酸同源性分別為99.4 %、97.9 %、99.7 %、99.6 %、98.0 %、99.7 %、97.8 %、99.0 %。通過對其序列進行的測定，有利于進一步從分子水平研究PRV在某些地區(qū)的流行、變異規(guī)律，也為PRV的診斷和預(yù)防奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：偽狂犬病毒；gE基因；克隆；序列分析

中圖分類號：S852.4+3 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）03-0058-03

偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（PRV）引起的一種高度接觸性、急性傳染病，可以感染多種家畜和野生動物[1]，豬是PRV 的主要宿主，也是感染后可以存活的唯一物種。感染后臨床癥狀因日齡不同而表現(xiàn)不一，仔豬高度易感，2周內(nèi)的發(fā)病率可達100 %，主要表現(xiàn)為拉稀、嘔吐和嚴重的神經(jīng)癥狀，死亡率高，生長育肥豬的常見癥狀為呼吸道癥狀，生長減慢，嚴重掉膘，妊娠母豬出現(xiàn)返情、流產(chǎn)、死胎和產(chǎn)弱仔[2]。近年來，隨著PRV 基因缺失活疫苗的普遍應(yīng)用，該病基本得到了有效控制，只有個別豬場出現(xiàn)散發(fā)病例，但2011年以來，許多使用基因缺失活疫苗免疫的規(guī)模化豬場出現(xiàn)了疑似偽狂犬流行，主要表現(xiàn)為豬群gE抗體陽性率顯著升高，母豬出現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)死胎，弱仔，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等[3]。PRV 屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科。病毒基因組為雙鏈DNA，大小約為150 kb，可以編碼70～100種病毒蛋白。在眾多的病毒蛋白中，gE糖蛋白是其主要毒力因子之一，并作為標志基因用來區(qū)分疫苗免疫和野毒感染[4]。

本研究通過對河南原陽一家已免疫偽狂犬疫苗仍發(fā)病豬場分離的偽狂犬病毒進行了gE全基因的克隆和測序，并與國內(nèi)外其他8株P(guān)RV 分離株的gE核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列進行比較，構(gòu)建遺傳發(fā)育進化樹，推測病毒來源及親緣關(guān)系，進而分析目前河南的PRV 分子流行病學(xué)特點，為預(yù)防豬偽狂犬病和制備合適的疫苗提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株，菌種和質(zhì)粒

豬偽狂犬病毒原陽株由河南省動物性食品安全重點實驗室分離并保存?；蚬こ叹鶧H5α購自寶生物工程（大連）有限公司，pMD?18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要試劑 PrimeSTAR?GXL DNA聚合酶，T 4DNA連接酶，瓊脂糖，X-gal和IPTG，DNA Maker DL2000，DNA Maker DL5000，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、PstⅠ等購自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物等為OXOID公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒購自北京TIANGEN公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸员本┎┐筇┛松锘蚣夹g(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

參照GenBank中發(fā)表的偽狂犬gE基因序列，利用Primer Primer 5.0軟件，設(shè)計一對引物，用于擴增gE全基因，該對引物理論跨幅1 862 bp。引物本身不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，兩條引物間不形成二聚體。引物由上海生物工程公司合成。上游引物序列P1為5’-GGTGTGGGTGGCGTTTTATCT-3’下游引物序列P2為5’-TTTGGTGGGCATGTCGGAATG-3’

1.4 偽狂犬病毒DNA的提取

將豬偽狂犬病毒原陽株細胞培養(yǎng)毒反復(fù)凍融3次。按照下面的步驟提取DNA：取細胞毒培養(yǎng)液300 μL加入等體積的裂解液37 ℃作用2 h；加入600 μL的飽和平衡酚混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇12 000 r/min離心5 min；取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇12 000 r/min離心5 min；取上清，加入等體積氯仿12 000 r/min離心 5 min；取上清，加入1.5倍異丙醇-70 ℃放置40 min；12 000 r/min離心5 min，用70 %的乙醇洗滌2次；自然風(fēng)干，加入25 μL滅菌三蒸水，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 偽狂犬病毒gE全基因的PCR擴增

取1μL已提取的模板DNA，1μL PrimeSTAR?GXL， 5 μL 5×PrimeSTAR?GXL Buffer，2 μL dNTP Mixture，上、下游引物各0.5 μL，去離子水15 μL于EP管中，離心混勻，然后進行PCR擴增。反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 3 min， 98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 2 min，35個循環(huán)，最后 4 ℃ 10 min。同時設(shè)立無模板的陰性對照。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）進行電泳檢測PCR結(jié)果。

1.6 偽狂犬病毒gE全基因的克隆

將電泳回收產(chǎn)物與pMD?18-T Vector載體進行連接反應(yīng)，16 ℃作用12 h，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，在含有X-gal、IPTG和Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h，挑取白色菌落接種含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)14 h。按質(zhì)?；厥赵噭┖姓f明進行提取重組質(zhì)粒，再進行PCR及酶切電泳檢測鑒定。選擇酶切和PCR鑒定為PRV gE全基因的重組陽性質(zhì)粒送上海生物工程有限公司進行序列測定。

1.7 gE全基因的序列分析

用DNAstar和BioXM2.6生物軟件對所測定的PRV gE基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析，并與GenBank中收錄的其他毒株的序列進行比較，分析它們之間的同源性及變異程度。

2 結(jié)果

2.1 gE全基因的PCR擴增

利用特異性引物，采用PCR技術(shù)從豬偽狂犬病毒原陽株細胞毒基因組DNA中擴增出1條約1 900 bp的片段（圖1），與預(yù)期擴增片段大小吻合。

2.2 重組質(zhì)粒的克隆及鑒定

將gE基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，插入到pMD?18-T載體的外源基因插入位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后挑選白色菌落，直接以菌液為模板進行PCR擴增、電泳，出現(xiàn)一條長約1 900 bp的條帶；抽提重組質(zhì)粒再進行PCR擴增、電泳，同樣也出現(xiàn)一條長約1 900 bp的特異條帶；重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、PstⅠ做雙酶切鑒定，分別獲得1條約2 700 bp和1 900 bp左右的條帶（圖2），與預(yù)期大小相符。

2.3 gE全基因的序列測定及分析

選擇酶切和PCR鑒定為gE全基因重組陽性的菌液送上海生物工程有限公司，進行正反兩個方向的序列測定，報告的gE基因核苷酸序列為1 862 bp，包含一個完整的開放閱讀框，長1 740 bp，編碼579個氨基酸，G+C含量為73.91 %，其中有98 %的gE基因密碼子的第二位是G或C。gE蛋白中有含丙氨酸12 %，脯氨酸11 %，苷氨酸8 %，精氨酸8 %，結(jié)果見圖3。

2.4 偽狂犬病毒原陽株gE基因與其他毒株gE基因核苷酸序列同源性比較及系統(tǒng)進化分析

運用DNAstar軟件將PRV 原陽株gE基因序列與從GenBank下載讀取的馬來西亞株（FJ176390）、愛爾蘭Nia-1株（FJ605136）、湖北Ea株、韓國株（AY249861）、美國Becker株（AY368490）、廣東SH株（EF552427）、西班牙株（EU502923）、河南焦作株（EU561349）等的gE基因進行同源性分析比較（見表1），得出的核苷酸同源性分別為99.4 %、97.9 %、99.7 %、99.6 %、98.0 %、99.7 %、97.8 %、99.0 %。其中與湖北Ea株、廣東SH株同源性最高，達到99.7 %，而與愛爾蘭Nia-1株、西班牙株等歐洲毒株的同源性相對較低，為97.9 %和97.8 %。通過對gE基因進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)兩個較大的分支，分別為亞洲毒株和歐美毒株，原陽株處在一個獨立的分支，其與焦作株、湖北Ea株、廣東SH、韓國株、馬來西亞株同處一個大的分支，表明他們的親緣關(guān)系相對較近，其中原陽株與湖北Ea株、廣東SH株親緣關(guān)系最近，而與愛爾蘭Nia-1株、美國Becker株、西班牙株完全處在2個不同的大分支中，表明它們的親緣關(guān)系相對較遠，結(jié)果見圖4。

3 討論

偽狂犬病毒是皰疹病毒科中感染動物范圍廣泛和致病性較強的一種。各種年齡的豬都易感，但隨著豬的年齡不同，癥狀和死亡率也有顯著區(qū)別，但一般不呈現(xiàn)瘙癢癥狀。哺乳仔豬最為敏感，發(fā)病后呈急性型致死過程[5]。近年來，豬偽狂犬病臨床發(fā)病有逐漸上升的趨勢，尤其是一些免疫控制比較好的規(guī)?；i場也突然發(fā)病[6]，2013年2月份以來河南出現(xiàn)了偽狂犬的大面積爆發(fā)流行，母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)，產(chǎn)死胎，產(chǎn)房仔豬出現(xiàn)腹瀉和神經(jīng)癥狀，仔豬死亡率60 %以上，部分豬場育肥豬也出現(xiàn)發(fā)病死亡，母豬野毒感染率70 %以上，豬場飼養(yǎng)的犬、貓出現(xiàn)大量感染死亡，大多數(shù)已免疫偽狂犬活疫苗的豬場也同樣出現(xiàn)發(fā)病死亡現(xiàn)象，給廣大豬場帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

本實驗應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)，設(shè)計合成了1 對引物，從PRV 原陽株中成功克隆出了PRV gE全基因，經(jīng)序列測定，擴增的gE基因全長為1 862 bp，包含了1 740 bp的完整開放閱讀框，通過把PRV原陽株gE基因與國內(nèi)外已公布的gE基因序列進行核苷酸同源性比較，發(fā)現(xiàn)其同源性均在97 %以上，這說明PRV 原陽株與國內(nèi)外毒株的gE基因具有較嚴格的保守性，與皰疹病毒科膜蛋白保守性的研究結(jié)果相符[4]，系統(tǒng)進化分析顯示，PRV原陽毒株與國內(nèi)毒株、馬來西亞、韓國毒株處在一個較大分支上，具有較高的親緣關(guān)系，但新分離的原陽株處在一個獨立的分支，表明與以往分離的PRV gE基因相比，該分離株出現(xiàn)了一定的基因變異現(xiàn)象，這與彭金美[3]、童武[7]報道的實驗結(jié)果相一致。是否這種變異導(dǎo)致了目前偽狂犬病毒毒力的增強和現(xiàn)用疫苗的免疫失敗，還有待進一步的研究確認。

在當前偽狂犬野毒嚴重感染的情況下，疫苗免疫接種仍是目前預(yù)防和控制本病的主要措施。研究證明，當豬場同時接種兩種不同的基因缺失疫苗后，病毒會發(fā)生基因重組現(xiàn)象，這應(yīng)引起注意。因此，在同一個動物體中只準使用一種基因缺失苗，以避免疫苗毒株間的重組[8]。雖然當前某些免疫過偽狂犬疫苗的豬場仍有發(fā)病情況，但臨床實踐發(fā)現(xiàn)，通過應(yīng)用正規(guī)廠家，高抗原含量的偽狂犬活疫苗進行緊急免疫接種，能夠明顯控制臨床癥狀的發(fā)生，使偽狂犬病趨于穩(wěn)定，另外，通過偽狂犬活疫苗對仔豬進行早期噴鼻免疫可以有效阻斷野毒在三叉神經(jīng)的潛伏感染，同時避免仔豬喝掉和甩出疫苗引起的免疫失敗。因此，對于目前流行的偽狂犬病，建議豬場應(yīng)用高效價偽狂犬疫苗進行母豬1年4次普免，商品豬1～3日齡噴鼻免疫，35日齡肌注1次，65日齡再肌注一次的免疫程序。□□

參考文獻：（15篇，略）