電針對(duì)帕金森病大鼠海馬組織MAP4K3/MKK4/JNK通路的影響

朱福連，梁培日，張創(chuàng)良

(海南省干部療養(yǎng)院，海南省老年病醫(yī)院 內(nèi)科， 海南 海口 571100)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性退行性疾病之一，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為肌強(qiáng)直、靜止性震顫、姿勢(shì)平衡障礙和運(yùn)動(dòng)遲緩等特征性運(yùn)動(dòng)癥狀，但也有精神障礙、認(rèn)知障礙等非運(yùn)動(dòng)伴隨癥狀，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[1-2]。目前臨床缺乏根治PD的特效藥物，但在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面，越來越多的研究熱點(diǎn)集中到了中醫(yī)領(lǐng)域[3]。針灸作為中醫(yī)領(lǐng)域傳統(tǒng)的治療方式，已廣泛應(yīng)用于改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如延緩阿爾茨海默病進(jìn)展[4-5]。近年來，針灸在PD疾病治療中亦得到很好的應(yīng)用，但由于針灸作用靶點(diǎn)眾多，針灸治療PD疾病的機(jī)制尚未完全明確[6-7]。絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 3，MAP4K3)在腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，近年來發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶激酶4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4)/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)在腦出血大鼠神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮重要作用[8]，但在PD疾病中尚無研究。本研究將觀察電針對(duì)PD大鼠海馬組織MAP4K3/MKK4/JNK通路的影響，以期探討電針治療PD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量為(200±10)g，SPF級(jí)，由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0001。

1.1.2 試劑與儀器 6-OHDA(貨號(hào)：S30042)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；HE試劑盒(貨號(hào)：AR1180)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；TUNEL試劑盒(貨號(hào)：QIA33)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich；兔源MAP4K3抗體(貨號(hào)：orb588710)購(gòu)自Biorbyt；兔源p-MKK4抗體、兔源MKK4抗體、兔源p-JNK抗體、兔源JNK抗體、兔源Bax抗體、兔源cleaved caspase-3抗體、兔源GAPDH抗體、羊抗兔IgG(貨號(hào)：ab278619、ab33912、ab124956、ab179461、ab32503、ab32042、ab181602、ab6721)購(gòu)于美國(guó)Abcam；電針治療儀(G6805-2A型)購(gòu)于上海華誼儀器制造廠；BX53顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯；Ti2熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon；GS-800凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 PD大鼠造模 采用6-OHDA雙靶點(diǎn)注射法復(fù)制PD模型大鼠[9]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按0.35 g/kg給予大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉、固定，用腦立體定位儀定位黑質(zhì)致密部及中腦腹側(cè)被蓋區(qū)。顱頂常規(guī)備皮，剪開頭皮，使用微量注射器在以上兩點(diǎn)緩慢注射1 μL 4 μg/μL 6-OHDA，注射后留針5 min再緩慢退針，縫合切口，腹腔注射青霉素預(yù)防感染。造模1周后，向造模大鼠進(jìn)行0.5 mg/kg阿撲嗎啡腹腔注射，誘發(fā)其旋轉(zhuǎn)，記錄30 min內(nèi)大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于210圈的大鼠即為PD造模成功的大鼠。

1.2.2 大鼠分組及電針干預(yù) 將PD造模成功的大鼠分為PD模型組及電針干預(yù)組，每組16只，另取16只未經(jīng)造模的大鼠為對(duì)照組。電針干預(yù)組大鼠參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜定位百會(huì)穴、風(fēng)府穴和太沖穴[10]，在以上穴位進(jìn)針并連接電針治療儀治療40 min，設(shè)置電流頻率2 Hz，強(qiáng)度0.6 mA，以大鼠頭部、腳趾發(fā)生微顫為度，每日電針治療1次，治療4周結(jié)束。對(duì)照組、PD模型組大鼠每日相同時(shí)間抓取在實(shí)驗(yàn)?zāi)景迳瞎潭?0 min。

1.2.3 大鼠記憶、行為學(xué)功能測(cè)試 末次治療結(jié)束后次日，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試各組大鼠記憶功能及行為學(xué)功能。①M(fèi)orris水迷宮實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備直徑1 m的圓形水池，正中立有直徑15 cm的圓柱形平臺(tái)，池內(nèi)放21℃左右的水，水面高出平臺(tái)約2 cm。提前訓(xùn)練4 d，每日將大鼠從不同方向面向池壁放入水中，記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期，60 s內(nèi)仍未找到平臺(tái)的大鼠，可用導(dǎo)向桿做適當(dāng)引導(dǎo)，并使大鼠停留在平臺(tái)上10 s以強(qiáng)化記憶。第5天撤除平臺(tái)，保持大鼠從同一位置放入水中，記錄其到原平臺(tái)位置所用時(shí)間(逃避潛伏期)及在原平臺(tái)位置停留的時(shí)間(原平臺(tái)停留時(shí)間)。②曠場(chǎng)試驗(yàn)：準(zhǔn)備100 cm×100 cm×50 cm的曠場(chǎng)反應(yīng)箱，底部用25 cm×25 cm格子標(biāo)注，上方懸掛可觀察整個(gè)反應(yīng)箱底部的攝像頭，置于安靜、昏暗的環(huán)境，將大鼠放入中間的格子，待其適應(yīng)10 min后，記錄大鼠在5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況，統(tǒng)計(jì)水平運(yùn)動(dòng)得分(雙前肢沿直線每行走10 cm或穿過1格記1分)及垂直運(yùn)動(dòng)得分(雙前肢離開地面到放下記1分)。

1.2.4 大鼠海馬組織病理學(xué)檢查 大鼠進(jìn)行記憶、行為學(xué)功能測(cè)試后，每組取8只斷頭處死，分離腦中海馬組織。將海馬組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水透明后，使用石蠟包埋，切片(5 μm)，烘干后脫蠟、水化，使用HE試劑盒進(jìn)行染色，脫水、透明后封片觀察。

1.2.5 大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 取海馬組織切片，TUNEL法檢測(cè)組織中細(xì)胞凋亡情況。切片常規(guī)脫蠟、水化，浸入0.85% NaCl溶液中5 min洗脫樣品，PBS洗滌。用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌。滴加蛋白酶K孵育15 min、4%多聚甲醛固定5 min進(jìn)行通透，PBS洗滌。滴加平衡緩沖液放置10 min預(yù)平衡。用dUTP標(biāo)記的rTdT孵育緩沖液覆蓋組織，于濕盒中37℃避光孵育60 min，后放入2X SSC靜置15 min終止反應(yīng)，PBS洗滌。DAPI染核，封片，熒光顯微鏡觀察，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 大鼠海馬組織中MAP4K3/MKK4/JNK通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 將剩余8只大鼠斷頭處死，分離腦中海馬組織，RIPA裂解液提取其中蛋白，取40 μg樣本沸水浴變性，用10% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，將PVDF膜與一抗(兔源MAP4K3抗體、兔源p-MKK4抗體、兔源MKK4抗體、兔源p-JNK抗體、兔源JNK抗體、兔源Bax抗體、兔源cleaved caspase-3抗體、兔源GAPDH抗體)4℃孵育過夜，在室溫下與羊抗兔二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，凝膠成像儀采集圖像，分析條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠記憶、行為學(xué)功能 與對(duì)照組相比，PD模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，原平臺(tái)停留時(shí)間顯著縮短(P<0.05)，水平運(yùn)動(dòng)得分及垂直運(yùn)動(dòng)得分顯著降低(P<0.05)；與PD模型組相比，電針干預(yù)組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，原平臺(tái)停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，水平運(yùn)動(dòng)得分及垂直運(yùn)動(dòng)得分顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期、原平臺(tái)停留時(shí)間、水平運(yùn)動(dòng)得分及垂直運(yùn)動(dòng)得分比較

2.2 各組大鼠海馬組織病理變化 HE染色可見，對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)元排列規(guī)律，胞核形態(tài)規(guī)則；PD模型組海馬區(qū)神經(jīng)元稀少，排列紊亂、疏松，細(xì)胞核可見固縮、溶解；與PD模型組相比，電針干預(yù)組海馬區(qū)神經(jīng)元病理改變輕微，僅存在少量胞核固縮、溶解(見圖1)。

A:對(duì)照組； B:PD模型組；C:電針干預(yù)組;×200。圖1 HE染色觀察海馬組織病理變化

2.3 各組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡情況 與對(duì)照組相比，PD模型組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與PD模型組相比，電針干預(yù)組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05，見圖2、表2)。

A:對(duì)照組；B:PD模型組；C:電針干預(yù)組;×200。圖2 TUNEL染色觀察海馬組織中細(xì)胞凋亡

表2 各組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率比較

2.4 各組大鼠海馬組織中MAP4K3/MKK4/JNK通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，PD模型組大鼠海馬組織中MAP4K3/GAPDH、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與PD模型組相比，電針干預(yù)組大鼠海馬組織中MAP4K3/GAPDH、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，見圖3、表3)。

圖3 各組大鼠海馬組織中MAP4K3/MKK4/JNK通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表3 各組大鼠海馬組織中MAP4K3/GAPDH、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)水平比較

2.5 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，PD模型組大鼠海馬組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與PD模型組相比，電針干預(yù)組大鼠海馬組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，見圖4、表4)。

圖4 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表4 各組大鼠海馬組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

PD是常見于老年人群的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，近年來隨著社會(huì)老齡化程度的逐漸加劇，其發(fā)病率逐漸升高，不僅從身體、心理層面上給患者帶來痛苦，也給其家屬及社會(huì)增添了沉重的負(fù)擔(dān)[11-12]。6-OHDA注射誘導(dǎo)是一種目前公認(rèn)的PD造模方法[13]，本研究采用該方法建立PD大鼠模型，以阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)超過210圈/30 min為造模成功，可見大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，原平臺(tái)停留時(shí)間縮短，水平運(yùn)動(dòng)得分及垂直運(yùn)動(dòng)得分降低，說明大鼠學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)能力均降低。HE染色及TUNEL染色可見PD大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率升高，神經(jīng)元稀少且排列紊亂、疏松，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、溶解，說明PD發(fā)病后海馬組織已發(fā)生病理學(xué)改變，神經(jīng)元損傷嚴(yán)重。

大量研究表明，針灸刺激穴位可以改善PD患者癥狀，提高認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)功能[14-15]。馬駿等[10]發(fā)現(xiàn)，采用電針刺激PD大鼠風(fēng)府穴、太沖穴，可減少多巴胺能神經(jīng)元凋亡。于建軍[16]研究顯示，電針刺激百會(huì)穴、印堂穴、太沖穴和三陰交穴，可改善帕金森抑郁大鼠的行為學(xué)功能。王述菊等[17]研究顯示，艾灸風(fēng)府、關(guān)元、足三里穴可治療PD大鼠。百會(huì)穴是腦病的特效穴，可改善腦組織血液循環(huán)，增強(qiáng)記憶力，發(fā)揮腦保護(hù)作用[18]。本研究通過電針刺激PD大鼠的百會(huì)穴、風(fēng)府穴和太沖穴的治療結(jié)束后，PD大鼠逃避潛伏期縮短，原平臺(tái)停留時(shí)間延長(zhǎng)，水平運(yùn)動(dòng)得分及垂直運(yùn)動(dòng)得分升高，提示電針治療可明顯改善PD大鼠的認(rèn)知功能、運(yùn)動(dòng)功能。HE染色及TUNEL染色可見PD大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率降低，病理改變減輕，同時(shí)海馬組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白水平降低，提示電針治療可降低凋亡相關(guān)因子表達(dá)，減輕PD發(fā)病帶來的海馬神經(jīng)元損傷，以致與該區(qū)域相關(guān)的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能得以提高。

MKK4是MAPK激酶，可激活JNK通路，進(jìn)而參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展[19]。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制MKK4/JNK/c-Jun信號(hào)通路激活，可對(duì)PD小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。MAP4K3是STE20樣絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，在腫瘤中具有抑癌作用。楊慧等[8]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制MAP4K3/MKK4/JNK信號(hào)通路，可減少腦出血大鼠神經(jīng)元凋亡。本研究顯示，建立PD模型后，大鼠海馬組織中MAP4K3蛋白及MKK4、JNK蛋白的磷酸化水平升高，電針干預(yù)后，PD大鼠海馬組織中MAP4K3蛋白及MKK4、JNK蛋白的磷酸化水平降低，提示MAP4K3/MKK4/JNK信號(hào)通路激活參與PD發(fā)病過程，而電針干預(yù)可抑制MAP4K3/MKK4/JNK信號(hào)通路激活，并進(jìn)一步推測(cè)MAP4K3/MKK4/JNK信號(hào)通路亦是電針治療PD的干預(yù)靶點(diǎn)之一。

綜上所述，電針可抑制PD大鼠海馬組織中MAP4K3/MKK4/JNK通路的激活，保護(hù)海馬神經(jīng)元，提高認(rèn)知與運(yùn)動(dòng)功能。