miR-182-5p調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬促進胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

相綠竹 王曄 陳文 趙琦 彭瑞 牟曉峰★

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國消化道惡性腫瘤中居首位，2015年中國胃癌的患病人數(shù)為679 100，其中死亡人數(shù)為498 000[1]。早期胃癌多無明顯癥狀，大約有80%的胃癌患者在確診時已屬中晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，長期生存率仍然比較低[2]。因此進一步探討胃癌的發(fā)病機制，尋找胃癌的分子治療靶點具有重要的臨床意義。已有研究表明miR-182-5p 參與肺癌[3]、肝癌[4]以及乳腺癌[5]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但miR-182-5p在胃癌中的作用存在爭議[6-7]。自噬在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有雙重要作用，這可能與胃癌的分子類型、分期以及涉及的通路有關(guān)[8-9]。生物信息學(xué)分析表明miR-182-5p 可直接或間接作用于自噬通路的關(guān)鍵基因來調(diào)控胃癌細(xì)胞自噬，但胃癌中的miR-182-5p 的表達、自噬水平以及兩者對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響尚不明確。因此本研究通過探討miR-182-5p調(diào)節(jié)自噬對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，為尋找胃癌的分子治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞培養(yǎng)

收集的16 對胃癌和相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本（距癌組織2 cm，經(jīng)本醫(yī)院病理醫(yī)師鑒定癌旁組織無癌變），均來自青島市中心醫(yī)院2015年至2018年手術(shù)后取得，腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期（Tumor，Node，Metastasis，TNM）為T2N0M01B 期。患者年齡47～74歲，中位年齡63歲?；颊邊⑴c前均簽署知情同意書，標(biāo)本收集符合本院倫理委員會的要求。人胃癌細(xì)胞株BGC-823和正常胃上皮細(xì)胞GES-1 購自湖南豐暉生物科技有限公司，細(xì)胞系均用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的1640 培養(yǎng)基，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。特殊化學(xué)修飾的微小RNA 激動劑（miR-182-5p agomir）可增加miR-182-5p 的表達，特殊化學(xué)修飾的微小RNA 拮抗劑（miR-182-5p antagomir）可降低miR-182-5p 的表達，分別以特殊化學(xué)修飾的微小RNA 激動劑無模板對照物（miR-182-5p agomir no template control，miR-182-5p agomir NTC）和特殊化學(xué)修飾的微小RNA 拮抗劑無模板對照物（miR-182-5p antagomir no template control，miR-182-5p antagomir NTC）為對照，分為miR-182-5p agomir NTC組與miR-182-5p agomir組、miR-182-5p antagomir NTC組與miR-182-5p antagomir組。

1.2 主要儀器和試劑

實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器購自美國Applied Biosystem公司，免疫印跡裝置購自美國Bio-Rad公司，顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司。miR-182-5p agomir 與miR-182-5p agomir NTC、miR-182-5p antagomir 與miR-182-5p antagomir NTC 購自廣州銳博生物科技有限公司；Master Mix試劑購自美國Applied Biosystem公司；抗體購自英國Abcam公司[抗脂質(zhì)體1（Sequestosome1，SQSTM1或P62）抗體的貨號ab56416，抗Beclin1 抗體的貨號ab207612，抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B（microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，LC3B）抗體的貨號ab51520]；腺病毒-熒光標(biāo)簽蛋白-微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B 購自中國上海漢恒生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測miR-182-5p的表達

Trizol 法提取總RNA 后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，用特異性引物（has-miR-182-5p-F：GGG TTT GGC AAT GGT AGA ACT CA，has-miR-182-5p-R：CCA GTG CAG GGT CCG AGG T）進行擴增，以U6（U6-F：CTC GCT TCG GCA GCA CA，U6-R：AAC GTT CAC GAA TTT GCG T）為內(nèi)參。體系如下：模板4.6 μL，引物0.4 μL，Master Mix 5.0 μL。反應(yīng)程序為95℃3 min，95℃15 s、60℃1 min，執(zhí)行40個循環(huán)。

1.3.2 細(xì)胞熒光檢測自噬水平

以2×104個/孔的細(xì)胞密度種于已放置爬片的48 孔板中，培養(yǎng)12 h 后進行干預(yù)，同時每組均加HBAD-GFP-LC3B 病毒。繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，更換培養(yǎng)基，并補加干預(yù)物質(zhì)，48 h 后，預(yù)冷甲醇固定、4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚染色，封片后于顯微鏡下拍照統(tǒng)計。

1.3.3 免疫印跡法檢測蛋白的表達

細(xì)胞樣品提取總蛋白，并測定濃度。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，冰上轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），室溫封閉1 h 后，加入一抗（抗Beclin1 抗體、1∶5 000，抗P62 抗體、1∶1 000，抗LC3B 抗體、1∶3 000）4℃過夜孵育，用含0.05%吐溫-20 的緩沖鹽溶液（Tris 10 mM，NaCl 150 mM，pH7.5）洗膜后，加入二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，洗膜后顯影成像。

1.3.4 CCK-8（cell counting kit 8，CCK-8）法檢測細(xì)胞增殖

以8×103個/孔的細(xì)胞密度種于96 孔板中，12 h后進行干預(yù)，培養(yǎng)1、2、3、4 d。每孔加入10 μL CCK-8試劑后，孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔的光密度值。

1.3.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移

以6×105個/孔的細(xì)胞密度種于6 孔板中，12 h后進行劃痕，磷酸鹽緩沖液（0.01 M，pH 7.5）清洗3次后，于顯微鏡下拍照。每孔加入無血清培養(yǎng)基并進行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，于顯微鏡下拍照并計算細(xì)胞遷移率。

1.3.6 侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲

提前將Transwell 小室（一種有通透性的支架或膜濾器）的上室用基質(zhì)膠涂覆，然后將無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液，以2×104個/小室的密度接種于上室，下室中加入500 μL 含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h 后進行干預(yù)。48 h 后，4%多聚甲醛固定15 min、0.1%結(jié)晶紫染色5 min，磷酸鹽緩沖液淋洗后，于顯微鏡下拍照并統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)處理采用Graph Pad Prism 5 軟件自帶的統(tǒng)計學(xué)分析模塊進行。計數(shù)資料以%表示計量資料的表達用（）的形式表示。正態(tài)分布資料兩組之間的比較采用t檢驗，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-182-5p在胃癌組織和BGC-823細(xì)胞株中表達升高

相比于癌旁組織，胃癌組織中miR-182-5p 的表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.421，P＜0.05）（圖1A）；同樣，BGC-823細(xì)胞中miR-182-5p 的表達顯著高于正常胃上皮細(xì)胞GES-1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.757，P＜0.05）（圖1B）。

2.2 miR-182-5p增強胃癌細(xì)胞株BGC-823的自噬水平

相比于對照組，miR-182-5p agomir組自噬細(xì)胞百分比增加，自噬相關(guān)蛋白Beclin1增加、P62減少、LC3B-Ⅱ/Ⅰ增加，整體自噬水平增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1，圖2A，圖2B），而miR-182-5p antagomir組整體自噬水平減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2，圖2C，圖2D。

2.3 miR-182-5p促進胃癌細(xì)胞株BGC-823的增殖

相比于對照組，miR-182-5p agomir組細(xì)胞增殖能力增強，而miR-182-5p antagomir組細(xì)胞增殖能力降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.4 miR-182-5p促進胃癌細(xì)胞株BGC-823的遷移

相比于對照組，miR-182-5p agomir組劃痕面積明顯減?。▌澓坶]合百分比% 65.67±7.77vs45.33±11.93），細(xì)胞遷移能力明顯增強，而miR-182-5p antagomir組細(xì)胞遷移能力減弱（劃痕閉合百分比%25.67±5.89vs44.33±9.29），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

表1 miR-182-5p 過表達對胃癌細(xì)胞BGC-823 自噬水平的影響（±s）Table1 The effects of miR-182-5p overexpression on autophagy in BGC-823 cells（±s）

表1 miR-182-5p 過表達對胃癌細(xì)胞BGC-823 自噬水平的影響（±s）Table1 The effects of miR-182-5p overexpression on autophagy in BGC-823 cells（±s）

注：與agomir NTC組比較，a P＜0.05。

分組agomir NTC agomir t值P值自噬細(xì)胞百分比36.670±10.020 48.330±7.506a 8.030 0.015 Beclin1 1.059±0.181 1.395±0.172a 8.382 0.014 P62 1.053±0.189 0.665±0.115a 5.878 0.027 LC3B-Ⅱ/Ⅰ1.080±0.252 2.340±0.396a 15.130 0.004

表2 miR-182-5p 低表達對胃癌細(xì)胞BGC-823 自噬水平的影響（±s）Table2 The effects of low expression of miR-182-5p on autophagy in BGC-823 cells（±s）

表2 miR-182-5p 低表達對胃癌細(xì)胞BGC-823 自噬水平的影響（±s）Table2 The effects of low expression of miR-182-5p on autophagy in BGC-823 cells（±s）

分組antagomir NTC antagomir t值P值自噬細(xì)胞百分比37.000±11.140 28.330±9.504 7.211 0.019 Beclin1 1.023±0.156 0.671±0.132 16.87 0.004 P62 1.017±0.355 1.557±0.221 4.356 0.049 LC3B-Ⅱ/Ⅰ1.085±0.258 0.503±0.166 5.916 0.027

2.5 miR-182-5p促進胃癌細(xì)胞株BGC-823的侵襲

miR-182-5p agomir組通過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)多于其對照組（970.0±180.0vs747.0±106.7），miR-182-5p antagomir組通過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)少于其對照組（537.0±84.5 vs 750.3±152.5）個，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）主要參與轉(zhuǎn)錄水平基因表達的調(diào)控，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。miR-182-5p在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的作用還存在爭議，有研究發(fā)現(xiàn)與健康人群相比，胃癌患者血清中miR-182-5p 的表達升高，可以作為潛在的生物標(biāo)志物[6]；Ramadan 等[10]人也發(fā)現(xiàn)胃癌患者的外周血和組織中miR-182-5p 的表達升高，且與患者較短的生存期和不良預(yù)后相關(guān)；有研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞HCG-27 中miR-182-5p 表達上調(diào)，且miR-182-5p 可通過下調(diào)Ras 相關(guān)蛋白Rab-27A（Ras-related protein Rab-27A，RAB27A）促進胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[11]，這提示miR-182-5p 可促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。然而，有研究發(fā)現(xiàn)miR-182-5p在胃癌組織中顯著低表達，過表達miR-182-5p 可抑制胃癌細(xì)胞的增殖以及集落形成，同時發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中癌基因ANUBL1[即鋅指，AN1型結(jié)構(gòu)域4（zinc fnger，AN1-type domain 4，ZFAND4）]與miR-182-5p 形成負(fù)反饋環(huán)路，共同調(diào)節(jié)胃癌的進展[7]。存在以上差異可能是由于研究者所研究的細(xì)胞來源和類型不同所致，也可能與miR-182-5p和其上下游復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間相互作用有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在16 對胃癌組織和胃癌細(xì)胞BGC-823中miR-182-5p 表達升高，且下調(diào)miR-182-5p 的表達時，胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力減弱，支持了miR-182-5p 作為促癌分子的假設(shè)，為進一步的機制研究提供了新的實驗依據(jù)。

miRNA 可以直接或間接作用于自噬通路的關(guān)鍵基因，調(diào)控細(xì)胞自噬，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miR-423-3p 通過調(diào)節(jié)與B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白相互作用介導(dǎo)細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)分子（B-cell lymphoma-2 interactig mediator of cell death，Bim）的表達能夠激活具有促癌作用的自噬過程，促進腫瘤發(fā)展[12]，F(xiàn)an H 等[13]人也發(fā)現(xiàn)miRlet-7a 在胃癌細(xì)胞中通過靶向雷帕霉素不敏感的mTOR 分子伴侶（Rapamycin-insensitive companion of mTOR，Rictor）調(diào)節(jié)自噬過程，促進胃癌的發(fā)生發(fā)展，這提示降低miR-423-3p和miR-let-7a 的表達可以降低胃癌細(xì)胞自噬水平，從而達到抑制腫瘤生長的目的。當(dāng)然也有研究發(fā)現(xiàn)miR-1265 可以通過降低鈣結(jié)合蛋白39（calcium binding protein 39，CAB39）的表達，進而調(diào)節(jié)一磷酸腺苷激活蛋白激酶-哺乳動物雷帕霉素靶點（Adenosine Mono Phosphate-activated protein kinase-mammalian target of rapamycin，AMPK-mTOR）信號傳導(dǎo)途徑來抑制胃癌細(xì)胞自噬，進而抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進胃癌細(xì)胞的凋亡，為胃癌的治療提供潛在的治療靶點[14]。miRNA 對自噬的調(diào)控存在的這些差異可能與miRNA 分子的不同、所研究的胃癌分期不同以及信號通路的不同有關(guān)，需要明確miRNA 在自噬過程和腫瘤生長轉(zhuǎn)移中的作用，從而更好地為治療提供理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-182-5p 表達上調(diào)時，細(xì)胞自噬水平增強，提示胃癌細(xì)胞可通過自噬過程進行自我更新，進一步促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究將miR-182-5p 與細(xì)胞自噬相結(jié)合，不僅豐富了miRNA 的研究內(nèi)容，也為自噬的研究提供了不同的途徑。根據(jù)TargetScan 等數(shù)據(jù)庫預(yù)測可知，B 淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）是miR-182-5p 的靶基因之一，其負(fù)調(diào)控Beclin 1 的表達，增強細(xì)胞自噬水平，但miR-182-5p對自噬調(diào)控的具體分子機制仍需進一步研究?？偟膩碚f，本研究發(fā)現(xiàn)miR-182-5p 可能通過增強細(xì)胞自噬水平，促進胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這提示miR-182-5p 可作為胃癌治療的一個潛在靶點，進一步為胃癌的治療提供一定的參考。