咖啡及其制品中咖啡因HPLC測定的前處理方法研究

鄒冬梅等

摘 要 采用5種前處理方法分別對5個樣品進(jìn)行處理，并對HPLC測定咖啡因含量的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，建立了3種準(zhǔn)確、快速、安全的適宜不同樣品的咖啡因提取測定方法，其中三氯甲烷超聲萃取法效果最佳。該方法測定FAPAS對照樣品的咖啡因，其含量為395.47 mg/kg，相對誤差為0.9%，回收率達(dá)100.97%。該方法操作簡單、耗時少、精密度及準(zhǔn)確度高、測定適用范圍廣。

關(guān)鍵詞 咖啡及其制品；前處理；咖啡因

中圖分類號 S571.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Pretreatment Methods for Determination of Caffeine

in Coffee and Its Products by HPLC

ZOU Dongmei，YUAN Hongqiu， WU Qiong，

TANG Yongjiao， PANG Yongbo， XU Zhi

Analysis and Testing Centre， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Five pretreatment methods were used for five samples of coffee and its products respectively. The methods for extracting caffeine and HPLC determination of caffeine content of the samples were optimized and improved， and three new methods for caffeine determination were established. And they are accurate， rapid， safe and suitable for extracting caffeine from different samples. The results showed that the method of chloroform together with ultrasonic extraction was the best， and using this method to determine the caffeine content of FAPAS control sample showed that its caffeine content was 395.47 mg/kg， the relative error was 0.9% and the recovery rate was 100.97%. Meanwhile， the method had advantages of simple operation， less time consuming， high precision and accuracy， and it had features of wide application.

Key words Coffee and its products；Pretreatment determination methods；Caffeine content

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.031

咖啡因（caffeine）又名咖啡堿，化學(xué)名稱為1，3，7，-三甲基黃嘌呤，屬生物堿類化合物。它具有等刺激中樞神經(jīng)作用，對神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、腫瘤化療的生化調(diào)節(jié)、神經(jīng)官能癥和偏頭痛等均有一些積極作用[1-2]，但易上癮。目前，測定咖啡因的方法有高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法、碘量法、重量法和分子印跡毛細(xì)管整體柱液相色譜法等，常用的方法為高效液相色譜法（HPLC）[3-7]。傳統(tǒng)的HPLC測定前處理方法操作繁瑣，且咖啡因提取率不高，導(dǎo)致重復(fù)性差、準(zhǔn)確度低。為建立準(zhǔn)確、快速、操作簡便的咖啡因HPLC測定的前處理方法，本研究在現(xiàn)有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上對提取測定方法進(jìn)行研究和優(yōu)化，比較不同前處理方法咖啡因測定結(jié)果的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待測材料 樣品材料5個（表1），樣品經(jīng)粉碎并過25目篩后待測。

1.1.2 主要試劑和儀器 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99.9%）購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；Waters 高效液相色譜儀（Waters e2695，配有2489紫外檢測器）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 樣品前處理方法共5種，其中處理3～5為本研究建立的新方法，分別如下：

處理1：按照GB/T 19182-2003/ISO 10095：1992試樣處理方法[3]。

處理2：按照GB/T 5009.139-2003第二法高效液相色譜法[4]。

處理3：稱取樣品0.5～1.0 g（精確至0.000 1 g）于150 mL的錐形瓶中，先加2～3 mL超純水，再加50 mL三氯甲烷，加蓋搖勻，在超聲處理機(jī)上萃取5 min，靜置30 min，分層。將萃取液移入另一250 mL的錐形瓶中，在試樣中再加40 mL三氯甲烷，重復(fù)上述萃取操作步驟，棄去試樣，合并2次萃取液，加入5 mL飽和氯化鈉和少量無水硫酸鈉（至液面無水花），過濾100 mL容量瓶中（用三氯甲烷洗錐形瓶和濾紙2次），用三氯甲烷定容至100 mL。吸取10.00 mL濾液到50 mL蒸餾瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入10 mL容量瓶中定容。吸取1～2 mL用0.22 μm微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶待測（棄去前3滴）。

處理4：分別稱取樣品1.0 g（精確至0.000 1 g）于150 mL 的錐形瓶中，加入4.0 g氧化鎂，再加入100 mL 蒸餾水，在恒溫振蕩水浴鍋中90 ℃水浴中浸提30 min，將溶液靜置，冷卻至室溫后過濾，濾液移入100 mL的容量瓶中，并用蒸餾水定容，稀釋10倍后，取1～2 mL過0.22 μm微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶待測（棄去前3滴）。

處理5：分別稱取樣品1.0 g（精確至0.000 1 g）于150 mL的錐形瓶中， 加入80 mL沸水， 加蓋搖勻，在恒溫振蕩水浴鍋中90 ℃水浴中浸提30 min，將溶液靜置， 冷卻至室溫，然后將浸出液全部移入100 mL容量瓶中， 加入2 mL醋酸鋅溶液（200 g/L）， 加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液100 g/L， 搖勻， 用超純水定容100 mL， 搖勻， 靜置沉淀，過濾。準(zhǔn)確吸取10 mL濾液至250 mL分液漏斗中，然后加入5 mL高錳酸鉀溶液（15 g/L）， 搖勻， 靜置5 min， 加入10 mL的亞硫酸鈉（100 g/L）和硫氰酸鉀（100 g/L）混合溶液（V ∶ V=1 ∶ 1），搖勻后，加入50 mL三氯甲烷。振搖100次（或2 min），靜止分層并收集三氯甲烷。在水層中再加入40 mL三氯甲烷，振搖100次（或2 min），靜置分層。合并2次三氯甲烷萃取液，并用三氯甲烷定容至100 mL，搖勻。吸10 mL濾液到25 mL蒸餾瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入100 mL容量瓶中定容。取1 ～2 mL過0.22 μm微孔濾膜過濾至上機(jī)瓶待測（棄去最初3滴）。

1.2.2 準(zhǔn)確度測定 參考物質(zhì)測試：以表1中的樣品1（參考物質(zhì)）為試樣，樣品前處理分別按1.2.1所述5種處理方法提取咖啡因并測定其含量。每種處理方法6個重復(fù)，比較測定值的平均值與樣品1（參考物質(zhì)）參考值，以測定5處理種方法的準(zhǔn)確度。

加標(biāo)回收率測試：以樣品1（參考物質(zhì)）為試樣，按1.2.1所述5處理種方法進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，每種方法3個水平的加標(biāo)回收，即在稱取的樣品中分別添加200、300、400 μg的咖啡因。依據(jù)加標(biāo)量及測定值計算每種處理方法各個水平的加標(biāo)回收率，以比較5種處理方法的準(zhǔn)確度。

1.2.3 精密度及測定適用范圍測定 按1.2.1所述5種前處理方法分別對4個不同咖啡因含量的樣品（編號分別為2、3、4、5）進(jìn)行前處理并測定咖啡因含量。每種處理方法重復(fù)做6個平行，依據(jù)測定值計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD范圍值≤2%），以比較5種處理方法的精密度及測定適用范圍。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 用萬分之一的電子分析天平稱取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品40.0 mg，將其移入50 mL的容量瓶中，并用超純水定容，即配得咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品母液（500 μg/mL）。再用移液管精確移取0.5、1、1.5、2、3 mL 的母液，分別移入 50 mL的容量瓶中，并用超純水定容，即得到濃度為5、10、15、20、30 μg /mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.5 色譜條件 色譜柱：Sun Fire C18 柱（4.6 mm×150 mm； 5μm）； 流動相： 甲醇 ∶ 水（V ∶ V=30 ∶ 70）； 流速： 1 mL/min；檢測波長：272 nm；柱溫為 35 ℃。

1.2.6 色譜測定 分別對5個樣品的待測溶液進(jìn)行測定，每個樣品重復(fù)6次，待測樣品進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，采用外標(biāo)法計算其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過Waters 高效液相色譜儀分析建立標(biāo)準(zhǔn)樣品的咖啡因色譜圖（圖1），咖啡因的保留時間約為4.4 min。以峰面積分值Y（μV·s）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），計算回歸方程，咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=2.626 78 X+1.233 13；相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

2.2 5種處理方法的準(zhǔn)確度比較

2.2.1 5種不同前處理方法的測定值與參考物質(zhì)的比較 由表2可知，處理1和處理2所測定的咖啡因含量分別為132.68、216.16 mg/kg，低于對照樣品，相對誤差分別為45.8%、66.7%；處理3～5所測定的咖啡因含量分別為395.47、367.36、376.99 mg/kg，與對照樣品相比，相對誤差分別為0.9%、7.9%和5.5%，其中處理3的準(zhǔn)確度最高。除處理1測定的咖啡因含量的RSD值<2%外，處理2～5的咖啡因含量的RSD值均小于2，說明這4種處理方法的測定精密度較高。

2.2.2 加標(biāo)回收率結(jié)果 由表3可知，5種處理方法的回收率分別為39.13%、69.27%、100.97%、96.68%和94.12%，RSD值分別為1.84%、1.94%、0.60%、1.55%和1.71%，其中處理3的回收率（正常范圍為80%～120%）最高，準(zhǔn)確度也最高。

2.3 3種新前處理方法的精密度與重復(fù)性比較

分別采用處理3、4、5對樣品2、3、4、5進(jìn)行前處理測定咖啡因含量，精密度試驗結(jié)果如表4，重復(fù)性試驗結(jié)果如表5。3種處理方法的RSD值均小于2%，說明3種處理方法的精密度高。在重復(fù)性試驗中，每個樣品重復(fù)6次，每次重復(fù)進(jìn)樣6次，計算6組的咖啡因含量平均值，RSD值也均小于2，說明3種處理方法的重復(fù)性好。因此，3種前處理方法適用于不同樣品的咖啡因含量測定。

2.4 5種前處理方法的綜合比較

由表6可知，處理3最準(zhǔn)確、簡單、快速、安全，峰型好、雜質(zhì)峰少（圖3），適用于精密測定咖啡及其制品中的咖啡因的含量，處理4和5準(zhǔn)確度較好，處理4適用大批量樣品的快速測定，處理5沒有雜質(zhì)峰，可用于科研分析或提取純化咖啡因。

3 討論與結(jié)論

本研究建立了3種準(zhǔn)確、簡單、快速、安全的適合不同樣品的咖啡因前處理定方法，即處理3、處理4、處理5。其測定結(jié)果明顯優(yōu)于目前的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 19182-2003和GB/T 5009.139-2003），即處理1和處理2。主要存在以下改進(jìn)：

處理3（三氯甲烷超聲萃取法）在處理2的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，測定方法準(zhǔn)確、精密。該方法的超聲萃取時間由處理2的1 min變?yōu)? min，色譜條件采用GB/T 19182-2003。2013年8月，筆者參加FAPAS的能力驗證（全球共73家單位參加），采用處理3提取樣品2和樣品3（考核樣）并測定咖啡因含量，標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)（z-score）值分別是-0.1和0.2。標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)的絕對值小于或等于2，則通過能力驗證，說明處理3測定結(jié)果的準(zhǔn)確度高并獲得國際認(rèn)可。

處理4（90 ℃水浴浸提取法）在處理1的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，測定方法安全、簡便、高效。該方法在水浴浸提時間和純化等方面進(jìn)行改進(jìn)，由處理1和國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 20481-2008）在恒溫振蕩水浴鍋中90 ℃水浴中浸提20 min變?yōu)?0 min，同時省去了提取液質(zhì)量稱重、溶液的提純、咖啡因的吸收、脫除不需要的化合物、咖啡因的洗提等5個步驟，溶液冷卻過濾后直接上機(jī)測樣。但是該前處理提取的咖啡因含雜質(zhì)較多，影響準(zhǔn)確度和色譜柱的使用壽命。

處理5（90 ℃水浴中浸提，三氯甲烷萃取法）的色譜峰較純凈且準(zhǔn)確，該方法綜合了處理1和處理2，即90 ℃水浴中浸提30 min后采用GB/T 5009.139-2003中紫外分光光譜法的試樣處理，但操作較繁瑣。

我國農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一般每3～5年修訂1次，但現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 19182-2003和GB/T 5009.139-2003）標(biāo)齡已有10 a，它不但操作繁瑣，而且在溶液提純過程中既難操作又不經(jīng)濟(jì)，準(zhǔn)確度和重復(fù)性也較差，建議有關(guān)部門盡快修訂該標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，處理1和4以90 ℃水浴浸提取，沒有使用有害的有機(jī)溶劑，相對于其它3種方法的安全性更高；其余3種提取方法使用三氯甲烷（低毒，對環(huán)境有危害，對水有污染）作為提取劑，如果操作人員經(jīng)過專門培訓(xùn)，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程（密閉操作，局部排風(fēng)），對人和環(huán)境不會造成明顯的安全問題。三氯甲烷超聲萃取法作為測定咖啡及其制品中咖啡因含量的前處理方法，其效果最佳，該方法具有操作簡單、耗時少、精密度和重現(xiàn)性好、回收率高、測定適用范圍廣等特點，將為今后咖啡及其制品中咖啡因含量的測定提供技術(shù)參考。

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責(zé)任編輯：古小玲