井岡霉素納米膠囊的制備及其對水稻紋枯病的抑菌防病研究

林志楷等

摘 要 以井岡霉素為芯材，利用微乳液聚合法制備納米級(jí)膠囊。結(jié)果表明：經(jīng)透射電子顯微鏡檢測，粒子分布均勻，粒徑在100 nm左右。對水稻紋枯病菌的室內(nèi)毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，井岡霉素納米膠囊半最大效應(yīng)濃度EC50=4.23 μg/mL，較原藥的藥效提高88倍。田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同為5 μg/mL的施用濃度井岡霉素納米膠囊防治效果為原藥的1.2倍。

關(guān)鍵詞 井岡霉素；納米膠囊；結(jié)構(gòu)表征；水稻紋枯??；毒力測定

中圖分類號(hào) S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Jinggangmycin Nanocapsules Preparation and the Inhibitory

Control of Rice Sheath Blight

LIN Zhikai， GUO Ying， LIN Qinghong， LIU Liqing， CHEN Fei， KE Hezuo

Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant，

Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China

Abstract Jinggangmycin nanocapsules with Jinggangmycin as the core material were prepared by microemulsion polymerization. Transmission electron microscopy（TEM）showed that all the sizes of nanocapsules were around 100 nm and uniform distribution. Against rice sheath blight indoor toxicity test results showed that the half effect concentration values（EC50）of Jinggangmycin nanocapsules was 4.23 μg/mL， with an efficacy 88-fold over the original drug. Field experiments showed that the treatment effect of Jinggangmycin nanocapsule was 1.2 times the original for the same 5 μg/mL concentration.

Key words Jinggangmycin； Nanocapsules； Structure characterization； Rice sheath blight； Toxicity test

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.026

井岡霉素是一種放線菌產(chǎn)生的抗生素，適用于防治絲核菌屬真菌病害和灰梨孢屬真菌病害，其防治效果高效、經(jīng)濟(jì)、與環(huán)境相容性較好。但井岡霉素與一些新開發(fā)的農(nóng)藥相比，其防效時(shí)間較短，防治病害種類較少，近幾年使用量有所下降。藥微膠囊制劑被認(rèn)為是當(dāng)前農(nóng)藥新劑型中技術(shù)含量最高的一種[1]。達(dá)到納米范圍的微膠囊稱為納米膠囊，因其具有良好的靶向性和緩釋作用[2]，逐漸成為農(nóng)藥研制領(lǐng)域中的新方向。近年來，國內(nèi)科研工作者已成功制備了天然除蟲菊酯和阿維菌素的納米膠囊劑[3-4]。

本研究通過微乳液聚合法成功制備了井岡霉素納米膠囊劑，并對制備出的納米膠囊進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征研究，對水稻紋枯病進(jìn)行了室內(nèi)毒力測定和田間防病試驗(yàn)。本制備方法原料廉價(jià)易得，成功率高，易操作，其藥效好，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與水稻品種 水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）GD-118菌株和水稻品種日本晴（Nipponbare）均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 60A井岡霉素原藥粉劑（有效成分60%）購自浙江桐廬匯豐生物化工有限公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 納米膠囊的制備 以井岡霉素原藥為芯材，以甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯為壁材，采用微乳液聚合法[5]，最終獲得了乳白色均相終濃度為3.3 mg/mL的井岡霉素納米膠囊產(chǎn)物，透過自然光肉眼觀察液體顯有藍(lán)光，靜置不分層。

1.2.2 結(jié)構(gòu)表征 取均一無沉淀的膠囊樣品，經(jīng)粒徑儀測試粒徑大小及分布；選取粒徑分布較為均勻，粒徑較為適中的樣品，用透射電子顯微鏡拍攝電鏡照片，觀察該膠囊樣品包裹情況。

1.2.3 井岡霉素原藥與納米膠囊的室內(nèi)毒力測定 井岡霉素對水稻紋枯病菌的毒力測定采用菌絲生長抑制率法[6]，生長培養(yǎng)基為含藥PDA平板培養(yǎng)基。將井岡霉素原藥設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度處理：0、2、10、25、50、250 μg/mL；將納米膠囊劑設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度處理：0、1、2、4、8、16 μg/mL。每個(gè)處理重復(fù)4次，用5 mm打孔器打取生長3 d的水稻紋枯病菌菌餅，置于各濃度含藥培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)42 h至對照菌落長至全皿時(shí)，測量處理菌落直徑并拍照記錄。計(jì)算菌絲生長抑制率，以濃度對數(shù)為x，以抑制率機(jī)率值為y，按最小二乘法求出用藥濃度對數(shù)與水稻紋枯病菌抑制機(jī)率值的回歸方程。并計(jì)算有效中濃度EC50。

菌絲生長抑制率=×100%

1.2.4 井岡霉素原藥與納米膠囊在田間水稻植株上的藥效測定 在室內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，參照張穗等[7]的實(shí)驗(yàn)方法，測量各接種部位病斑的擴(kuò)展長度，計(jì)算其防治效果。

防治效果=×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 井岡霉素納米膠囊的粒度分布及結(jié)構(gòu)

經(jīng)稀釋后檢測，所制得的納米膠囊的粒徑比較小，均在100 nm之內(nèi)，而且粒徑分布比較窄，粒度均勻，大都呈球型，呈分散狀態(tài)。圖1為放大80 000倍的井岡霉素納米膠囊劑透射電鏡照片。

2.2 室內(nèi)毒力測定結(jié)果

井岡霉素原藥對水稻紋枯病菌菌絲生長的抑制結(jié)果見表1和圖2。對表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行濃度/對數(shù)和抑制率/機(jī)率值的轉(zhuǎn)換，由此計(jì)算出井岡霉素在含毒平板上對水稻紋枯病菌的毒力回歸方程為：y=0.393 5x+3.986 9，相關(guān)系數(shù)r=0.988 1，理論抑制菌絲生長速率的EC50=375 μg/mL。

井岡霉素納米膠囊劑對水稻紋枯病菌的抑制結(jié)果見表1和圖3，計(jì)算出毒力回歸方程為y=2.357 7x+3.524 5，相關(guān)系數(shù)r=0.995 9，理論抑制菌絲生長速率的EC50=4.23 μg/mL。室內(nèi)毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示，井岡霉素納米膠囊較原藥的藥效提高了88倍。

2.3 田間藥效防治結(jié)果

由圖4可以看出，田間種植的水稻在感染病菌后，葉片上均產(chǎn)生云紋形病斑。其中空白對照組病害嚴(yán)重病斑平均長度為40 mm；井岡霉素原藥處理組病斑平均擴(kuò)展長度為10 mm；井岡霉素納米膠囊處理組病斑平均擴(kuò)展長度為5 mm。由表2可知，原藥的防治效果為75.0%，納米膠囊防治效果達(dá)到87.5%，為原藥的1.2倍。此結(jié)果顯示納米膠囊制劑的防治效果較原藥更為明顯。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明井岡霉素對水稻紋枯病菌生長有一定的抑制作用，抑制作用與用藥濃度呈正相關(guān)，這與前人的研究結(jié)果基本相同，研究中井岡霉素A室內(nèi)毒力測定半最大效應(yīng)濃度與諸多報(bào)道的并不一致，EC50=375 μg/mL要大大高于前人的研究結(jié)果[6-8]。分析其原因，可能有以下2種：一是受試病菌菌株不同，其耐藥能力有所差異，甚至有文獻(xiàn)報(bào)道存在個(gè)別抗藥性菌株[9]；二是井岡霉素組分多樣，各組分活性存在部分差異，前人經(jīng)組分測定認(rèn)為其包括8種組分，主要活性成分為 A組分，D組分活性最低[10-12]，而國內(nèi)所能購買到的各廠家生產(chǎn)的劑型和濃度純度又不盡相同，導(dǎo)致測試得出的EC50也不同。

近年來對井岡霉素的作用機(jī)理研究結(jié)果表明，井岡霉素具有對病原菌和寄主植物雙重作用的特性。井岡霉素可以激發(fā)水稻自身多種抗性防衛(wèi)反應(yīng)的表達(dá)[7， 13]。根據(jù)納米農(nóng)藥特性，藥物被納米膠囊包裹后其滲透性和內(nèi)吸作用將得到提高，使得藥物更容易進(jìn)入病原菌和植物體內(nèi)發(fā)揮作用。本研究針對井岡霉素的作用機(jī)理將其納米膠囊化，室內(nèi)毒力試驗(yàn)和田間試驗(yàn)的結(jié)果初步顯示，井岡霉素納米膠囊劑與原藥相比藥效顯著提高。采用微乳液聚合法制得的井岡霉素納米膠囊粒徑較為理想，無需后續(xù)處理，說明此方法在操作上可行，有利于工業(yè)化實(shí)施?；谑覂?nèi)毒力試驗(yàn)及張穗等[7]的研究結(jié)果，如適當(dāng)提高田間用藥濃度，納米膠囊的防病效果有望更理想，確立最佳施用濃度還需課題組進(jìn)行大面積的田間防治試驗(yàn)。

本研究在國內(nèi)首次成功制備出納米膠囊型抗菌劑。本試驗(yàn)結(jié)果表明運(yùn)用納米技術(shù)將井岡霉素納米膠囊化，能顯著提高其防治水稻紋枯病的效果，將其做為一種全新的劑型產(chǎn)業(yè)化前景廣闊。

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責(zé)任編輯：黃東杰