胡椒葉抗氧化物質提取條件初探

張水平等

摘 要 采用系統溶劑提取法處理胡椒葉，確定了胡椒葉的乙醇提取相和水提取相具有較強的DPPH自由基清除能力和較高的多酚含量；通過對胡椒嫩葉、完全穩(wěn)定葉和老葉的乙醇和水提取液的DPPH自由基清除能力和多酚含量的測量，得出胡椒嫩葉的多酚含量較高，抗氧化活性較高，老葉次之；采用不同濃度的乙醇水溶液常溫攪拌浸提胡椒老葉，得出50%左右的乙醇水溶液提取液具有較強的清除自由基能力，較高的多酚含量（5.4 g/100g）和黃酮類化合物含量（0.8 g/100g）。

關鍵詞 胡椒葉；抗氧化；DPPH自由基；多酚；黃酮類

中圖分類號 TS207.3 文獻標識碼 A

Primary Exploration of the Extraction Conditions of the

Antioxidant from Piper nigrum Linn. Leaves

ZHANG Shuiping1，2， GU Fenglin1，3，4 *， WU Guiping1，3，4， HE Shuzhen1，3，4， WANG Qinghuang1，3，4

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China

3 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture，

Wanning， Hainan 571533， China

4 National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract It was ascertained that the ethanol extraction phase and the water extraction phase possess the stronger activity of the DPPH free radical scavenging capacity and the higher levels of polyphenol content by the way of the system solvent extraction. It was concluded that older leaves had stronger antioxidant activity by comparing DPPH free radical scavenging capacity and polyphenol content of the tender leaves， the complete stability lobe and the old leaves. The solution from extraction using 50% ethanol water had stronger activity of free radical scavenging capacity and higher levels of polyphenol content（5.4 g/100g）and flavonoids content（0.8 g/100g）through room temperature agitation leaching using ethanol water with different concentration.

Key words Piper nigrum L. leaves； Antioxidant activity； Free radical scavenging activity； Polyphenolic； Flavonoids

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.019

胡椒（Piper nigrum L.），一種辛辣調味品，是印度傳統醫(yī)學廣泛應用的香辛料藥物之一[1]，而且在泰國的生藥市場上可以買到胡椒的葉和莖，說明當地人已經用胡椒葉來治療某些疾病[2]。另外同屬胡椒科胡椒屬的蒟（蔞葉）也有食用途徑，一是制作調味品蒟醬，二是取葉與檳榔一起嚼食[3]。Agbor等[4]研究發(fā)現胡椒葉的甲醇提取物具有顯著的抗氧化活性和抗動脈粥樣硬化功能，本課題組前期研究結果表明，胡椒葉比胡椒果具有更強的抗氧化活性[5]，所以胡椒葉可能具有潛在的開發(fā)應用價值。

福林酚試劑測量總酚是研究天然產物抗氧化活性的常用方法，它方便、簡單并且重現性好[6]；DPPH自由基清除能力的測定方法由Blois建立[7]，在活性物質抗氧化能力測定方面得到了非常廣泛的應用[8]。本研究就海南省廣泛種植的印尼大葉種胡椒的葉片，以DPPH·清除能力、多酚含量和黃酮類化合物含量為指標，選擇較為適合的胡椒葉片及提取方法，為胡椒葉的功能食品類或食品添加劑類的開發(fā)利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

完全穩(wěn)定胡椒葉 2012年12月10日采自中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所基地，真空冷凍干燥粉碎待用；不同成熟度胡椒葉[9][嫩葉、穩(wěn)定葉①、穩(wěn)定葉②、穩(wěn)定葉③（編號越大葉齡越大）和老葉]2013年3月21日采摘于中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所基地，真空冷凍干燥粉碎待用。

DPPH、福林酚試劑（美國Sigma公司）；沒食子酸和蘆?。兌?2.5%）（中國藥品生物制品檢定所）；無水三氯化鋁（AR）（廣東光華化學廠有限公司）；其它試劑（廣東省汕頭市西隴化工廠）。

FD-2真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；QE-300g高速萬能粉碎機（浙江屹立工貿有限公司）；specord 250plus紫外可見分光光度計（德國analyticjena公司）；天平RMPUT industry electronic balance；RV10旋轉蒸發(fā)儀digital IKA；MB45快速水分測定儀OHAUS；MS3 basic漩渦混合器（德國IKA公司）；Z36HK全能臺式高速冷凍離心機（德國Hermle公司）；HJ-4恒溫磁力加熱攪拌器（金壇市宏華儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 系統溶劑提取物制備 參考戴冰等[10]系統溶劑法提取工藝研究，并做適當調整。稱取50 g穩(wěn)定胡椒葉粉末，加入1 000 mL石油醚（bp60～90 ℃），常溫攪拌浸提10 h，過濾得浸提液于50 ℃下旋轉蒸發(fā)出大部分有機試劑后，轉移出來于50 ℃烘箱中干燥得L1；過濾所得殘渣中加入同樣體積乙酸乙酯同以上方法得L2；乙酸乙酯過濾所得濾渣同樣方法用無水乙醇浸提得L3；最后在殘渣中加入1 000 mL高純水浸提10 h ，70 ℃旋轉蒸發(fā)，真空冷凍干燥得L4。L1、L2、L3和L4存放在-23 ℃冰箱內待用。

1.2.2 不同成熟度胡椒葉提取液制備 提取液制備方法參考CELL BIOLABS，INC公司產品——OxiSelectTM Oxygen Radical Antioxidant Capacity（ORAC）Activity Assay的試劑盒產品手冊，產品編號為STA-345，并做適當改動。稱取一定質量凍干胡椒葉粉碎，過20目篩，稱取1.0 g粉末，加入20 mL乙醇旋流震蕩30 min，12 000 ×g、4 ℃下離心10 min，轉移出上層液，定容至50 mL；殘渣加入20 mL高純水，震蕩使充分混合，12 000 ×g、4 ℃下離心10 min，轉移出上層液，定容至50 mL，得提取液。

1.2.3 老葉的不同濃度乙醇水溶液的浸提液 參考Giorgia Spigno等[11]提取葡萄皮中酚類物質的方法并做適當調整。乙醇濃度分別為0、20%、40%、60%、80%和100%的高純水溶液常溫攪拌浸提4 g胡椒粉10 h，料液比1 ∶ 20（g/mL），過濾后定容至100 mL。

1.2.4 清除DPPH自由基能力的測定 參照文獻[12]的方法，略加調整。用無水乙醇制備濃度為1.0 mmol/L的DPPH自由基母液，使用時稀釋為0.2 mmol/L的溶液。用各自的提取溶劑把L1、L2、L3和L4配成0.3 g/mL的溶液作為樣品檢測。DPPH溶液與提取液等體積混合記為As，DPPH溶液與提取溶劑等體積混合為空白記為Ao，乙醇與提取液等體積混合為樣品對照記為Ax，以溶劑做參比。充分振蕩混合均勻，然后避光反應30 min，之后在517 nm下測量吸光度。DPPH自由基清除率、總清除能力計算公式如下：

DPPH自由基清除率/%=×100

1.2.5 提取物中多酚含量的測定 參考GB/T 8313-2008中的方法二。以沒食子酸標準曲線作為定量標準，相同質量原料提取液的多酚含量表示為每100 g干重原料中沒食子酸當量克數（g/100g）；用各提取溶劑把L1、L2、L3和L4配成0.3 g/mL的溶液作為樣品檢測。

1.2.6 提取物中總黃酮含量的測定 參考Francis M Awah等[13]的方法并做稍微改動。具體如下：100 μL的提取液2 結果與分析

2.1 系統溶劑提取液抗氧化能力比較

圖1表示胡椒葉系統溶劑提取物對DPPH自由基清除能力的強弱，自由基清除率越高，清除能力就越強。由圖1可知，乙醇提取物清除自由基能力最強，水提取物清除自由基能力次之；石油醚和乙酸乙酯提取物清除自由基能力最弱，且兩者沒有顯著性差異。圖2表示胡椒葉系統溶劑提取物中多酚含量的高低。由圖2可知，乙醇提取物多酚含量最高，水提取物的多酚含量次之；石油醚和乙酸乙酯提取物多酚含量最低，且沒有顯著性差異。

以多酚含量為自變量，DPPH自由基清除能力為因變量進行回歸分析得y=21.461x+22.693，R2=0.830 3，可知擬合度并不高，且二者的皮爾遜相關系數r=0.911 18，P=0.088 8>0.05，說明二者的相關性不存在統計學意義，這可能是因為提取物中還含有非酚類的抗氧化物質。

2.2 不同成熟度胡椒葉的抗氧化能力比較

由圖3可知，老葉醇提物清除自由基的能力最強，而嫩葉最弱；但由圖4可知，嫩葉水提物清除自由基的能力最強，而老葉和穩(wěn)定葉③次之。

由圖5可知，醇提部位老葉多酚含量最高，嫩葉多酚含量最低；由圖6可知，水提部位多酚含量嫩葉最高，老葉多酚含量最低。5種成熟度的胡椒葉片總多酚含量為嫩葉（5.6±0.200）g/100g、老葉（4.0±0.259）g/100g、穩(wěn)定葉①（3.2±0.225）g/100g、穩(wěn)定葉②（2.8±0.075）g/100g和穩(wěn)定葉③（2.9±0.067）g/100g。

醇提部位自由基清除能力與多酚含量回歸分析得：y=50.299x-14.476，R2=0.937 1，說明二者具有較高的擬合度，二者的皮爾遜相關系數為0.968 04，P=0.006 8<0.01，二者存在顯著的正相關關系；對二者進行水提部位自由基清除能力與多酚含量回歸分析得：y=16.457x+6.280 3，R2=0.901 5，說明二者具有較高的擬合度。二者的皮爾遜相關系數為0.949 47，P=0.013 5<0.05，這是因為酚類物質是天然產物中主要的抗氧化物質[15-16]，其酚羥基具有強烈的終止自由基的能力[17]。

2.3 老葉的不同濃度乙醇水溶液浸提液抗氧化能力比較

由上述2.1可知，胡椒葉片的醇提物和水提物都有較強的清除自由基能力，所以對不同濃度的乙醇水溶液提取物清除自由基的能力進行了比較。由圖7可知，當提取液的濃度較高時，40%和60%的乙醇提取液清除自由基的能力沒有顯著性差異，進一步稀釋提取液進行檢測，由圖8可知，40%的乙醇提取液清除自由基的能力最強。由圖9和圖10可知，40%和60%的乙醇提取液的多酚含量和黃酮類化合物的含量都是最高的，而且提取液中的黃酮類化合物可能主要為黃酮苷或極性較大的黃酮苷元[18]。

多酚含量和黃酮類物質含量的回歸方程為y=0.141 5x+0.023 6，R2=0.953 8，皮爾遜相關系數為0.976 60，P=0.000 8<0.001，表明提取液中多酚可能以黃酮類物質為主；多酚含量和清除自由能力的回歸方程為y=11.791x-8.673，R2=0.951 7，皮爾遜相關系數為0.975 57，P=0.024 4<0.05；黃酮類物質含量和清除自由能力的回歸方程為y=68.127x+0.438 4，R2=0.966 8，皮爾遜相關系數為0.983 27，P=0.016 7<0.05；這說明胡椒葉的水提取液中清除自由基的活性物質是多酚。

3 討論與結論

本研究通過系統溶劑法提取胡椒葉抗氧化成分，得到胡椒葉內抗氧化成分更易溶于乙醇和水，但是，由于本研究使用的檢測方法更適合極性較大的抗氧化物質的檢測，所以，石油醚浸提部位和乙酸乙酯浸提部位中也可能存在脂溶性的抗氧化物質有待進一步研究。

胡椒葉片是胡椒主要營養(yǎng)器官之一，它所含的化學物質隨葉位、葉齡而異[9]。本研究通過對胡椒不同成熟度的胡椒葉的抗氧化能力比較，得出胡椒老葉和嫩葉可能含有較多的水溶性和醇溶性的抗氧化物質，陳明等[19]也報道嫩葉和成熟葉在酚類物質含量和抗氧化活性方面有顯著的區(qū)別，其中嫩葉的多酚含量較高與本研究是一致的，這可能是因為嫩葉還沒有長出富含纖維的葉片支撐組織，從而使得多酚的相對含量較高。且考慮到嫩葉需要為分化的胡椒花芽提供營養(yǎng)，而且對胡椒進行疏葉也可促進胡椒的產量[20]，所以用老葉提取抗氧化物質更有可行性。

通過采用不同濃度的乙醇水溶液對胡椒老葉進行浸提，得出采用50%左右的乙醇水溶液能提出較多的抗氧化成分，其中多酚含量為5.4 g/100g，黃酮類物質含量0.8 g/100g。Francis M Awah等[13]對尼日利亞的7種特定藥用植物的的黃酮類物質含量和多酚含量進行測量，數據顯示含量較高的分別為0.6 g/100g和7 g/100g；Cai等[21]對112種傳統中藥植物多酚含量進行了測定，結果得出其平均值為3.5 g/100g左右，通過比較說明胡椒葉中的多酚含量和黃酮類物質的含量處于較高水平，具有開發(fā)利用的潛力。

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責任編輯：沈德發(fā)