海南粗榧外植體滅菌方法研究

王成韜 鐘秋平 李永成

摘 要 以海南粗榧（Cephalotaxus mannii Hk. f.）的枝條、葉為外植體進行愈傷組織誘導，采用升汞、次氯酸鈉與臭氧為消毒劑，探討不同滅菌方法對海南粗榧外植體污染和細胞活性的影響。結(jié)果表明，以升汞與臭氧復合處理的滅菌方法最佳，最佳滅菌條件為：75%酒精滅菌1 min，臭氧滅菌30 min，再用0.1% HgCl2溶液滅菌10 min。在此條件下，外植體污染率5%，愈傷組織誘導率95%，外植體細胞活力比對照提高38%。

關(guān)鍵詞 海南粗榧；臭氧滅菌；細胞活力；污染率

中圖分類號 Q942.6 文獻標識碼 A

Explants Sterilization Conditions of Cephalotaxus mannii Hk. f.

WANG Chengtao，ZHONG Qiuping，LI Yongcheng*

Food College， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract The branches and leaves of Cephalotaxus mannii Hk. f. were used as the explants for callus induction. In addition， mercuric chloride， sodium hypochlorite and ozone were used as the disinfectants. The impact of different sterilization methods on contamination rate and cell activity of explants was studied in the paper. The results were as follows： The combinative sterilization of mercuric chloride and ozone showed the best effect. Sterilization conditions were as follows： 75% alcohol for 1 min， ozone for 30 min and 0.1% HgCl2 solution for 10 min. It resulted in 5% of contamination rate of explants and 95% of callus induction rate， enhanced 38% of cell activity than the control under the sterilization conditions indicated as above.

Key words Cephalotaxus mannii Hk. f.；Ozone sterilization；Cell activity；Contamination rate

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.018

海南粗榧（C. mannii Hk. f.）是三尖杉科植物中分布最南的一種，是海南的特有植物。其中的抗癌活性成分三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、脫氧三尖杉酯堿和異三尖杉酯堿4種具有抗癌作用的粗榧堿在所有的三尖杉科三尖杉屬植物中含量最高，因此受到人們的廣泛關(guān)注[1]。海南粗榧人工繁殖很困難，且生長速度緩慢[2]。因此，采用組織培養(yǎng)合成這些抗癌生物堿是解決其藥源植物可持續(xù)發(fā)展的有效技術(shù)手段。張偉等[3]對三尖杉（C. fortunei）懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物堿進行了研究。在海南粗榧（C. mannii）的組織培養(yǎng)中， 符文英等[4]利用溫室苗作為外植體誘導愈傷組織獲得成功，劉進平[5]在利用野生海南粗榧誘導愈傷組織的過程中均出現(xiàn)嚴重污染，并指出野生海南粗榧污染嚴重，較難獲得愈傷組織。

外植體消毒滅菌，要求滅菌徹底，同時要求盡量減低對外植體細胞的傷害[6]。由于常年高溫多雨，空氣濕度大，熱帶、南亞熱帶生長的植物莖葉表面容易附生或共生各種微生物，它們可侵入植物表皮內(nèi)的薄壁組織，很難被清除而隨植物材料進入培養(yǎng)基中，引起組培中內(nèi)生菌污染[7-8]。朱廣廉[9]在熱帶植物相思樹外植體滅菌中采用殺菌劑苯菌靈、鏈霉素與升汞復合處理，取得了良好效果。在一定濃度下， 臭氧可迅速殺滅細菌、芽胞、病毒、真菌及其孢子等[10]，臭氧在水中的殺菌速度比氯快[11]，由于其安全方便、環(huán)保、消毒效果好、時間短等特點， 被制藥工業(yè)企業(yè)廣泛應用。為解決海南粗榧組織培養(yǎng)中外植體內(nèi)生菌的污染問題，本研究采用臭氧來殺滅植物內(nèi)生菌，以期獲得較好的滅菌效果，為建立海南粗榧離體培養(yǎng)技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

海南粗榧（C.mannii）外植體采自海南省儋州市熱帶植物園、霸王嶺國家自然保護區(qū)和尖峰嶺國家自然保護區(qū)。愈傷組織誘導培養(yǎng)基：MS+NAA 1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+2，4-D 2 mg/L+蔗糖30 g/L +卡拉膠6 g/L[4]。

1.2 方法

1.2.1 外植體的滅菌 外植體預處理，洗潔精液清洗15 min，流水沖洗30 min，然后用75%酒精滅菌1 min。

常規(guī)升汞滅菌法：選取海南粗榧嫩葉，經(jīng)預處理后用0.1%HgCl2溶液分別滅菌10、14、17、20 min，接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，并統(tǒng)計污染率與誘導率。

升汞和次氯酸鈉復合滅菌法[12]： 選取海南粗榧嫩葉做外植體，經(jīng)過預處理后，用5%次氯酸鈉溶液（有效氯）滅菌15 min，再用0.1% HgCl2溶液分別滅菌10、14、17、20 min，接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，統(tǒng)計污染率與誘導率。

升汞和臭氧復合滅菌法：選取海南粗榧嫩葉做外植體，經(jīng)過預處理后放入三角瓶并用無菌水浸泡，通入臭氧滅菌30 min，再用0.1% HgCl2溶液分別滅菌10、14、17、20 min，接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，統(tǒng)計污染率與誘導率。

殺菌劑和抗生素復合滅菌法[13-15]：選取海南粗榧嫩葉，將其放入1 ∶ 200新潔爾滅稀釋液中磁力攪拌15 min[16]，75%酒精滅菌1 min，轉(zhuǎn)入到0.2%苯菌靈+0.2%鏈霉素+0.02%檸檬酸溶液中，于25 ℃，100 r/min搖床上震蕩16 h，然后用0.1% HgCl2溶液分別滅菌10、14、17、20 min。

1.2.2 植物細胞活力檢測方法 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法[17]：剪碎100 mg海南粗榧嫩葉于試管中，加入3 mL TCC溶液（0.5 g TTC溶于100 mL，0.05 mol/L， pH 7.5的磷酸緩沖液中），在25 ℃下反應12 h。離心棄TTC溶液并收集植物材料，用蒸餾水清洗3次，加入3 mL 95%酒精后60 ℃恒溫水浴10 min，抽提植物材料中酶反應生成的紅色物質(zhì)，離心棄植物材料，冷卻，在492 nm處測吸光值。細胞活力單位以每克外植體（Fresh weight， FW）在492 nm處的吸光值表示（OD/g）。

植物細胞活力以相對活力表示，以未做滅菌處理的嫩葉為對照，其相對活力定義為1，外植體細胞相對活力=滅菌后外植體細胞活力/對照嫩葉細胞活力。

1.2.3 外植體的培養(yǎng) 外植體通過以上方法滅菌后，用200 mL去離子無菌水搖床清洗5次，每次10 min，然后用無菌濾紙吸干其表面水分，切為1.5 cm左右，然后接種到培養(yǎng)基中，每瓶2個外植體，27 ℃暗培養(yǎng)。每個處理接10瓶，每個處理重復3次，計算污染率、誘導率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)升汞滅菌對海南粗榧外植體污染與愈傷組織誘導的影響

由表1可知，污染率隨升汞滅菌時間的延長降低的；愈傷組織誘導率隨著升汞滅菌時間的增加而降低。說明滅菌時間對污染與愈傷組織誘導均有明顯影響；HgCl2對雜菌與植物細胞均有殺滅作用，過長的滅菌時間，同時也殺滅植物細胞。因而，17 min是一個較優(yōu)的滅菌時間。

2.2 升汞和次氯酸鈉復合滅菌法對海南粗榧外植體污染與愈傷組織誘導的影響

由表2可知，次氯酸鈉滅菌15 min后，HgCl2滅菌時間在14 min以上時，污染率為0；愈傷組織在HgCl2滅菌10 min的誘導率為60%，但在后續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)部分外植體褐變死亡的現(xiàn)象，隨著滅菌時間的延長，外植體全部褐變死亡，說明次氯酸鈉對植物組織有較大的損害作用。

2.3 升汞和臭氧復合滅菌對海南粗榧外植體污染與愈傷組織誘導的影響

由表3可知，臭氧滅菌30 min后，升汞滅菌10 min時，污染率只有5%，在14 min以上時，污染率均為0；升汞滅菌10 min誘導率為95%，與其它滅菌時間有明顯差異。升汞滅菌10 min，10 d后外植體即出現(xiàn)局部膨大現(xiàn)象。滅菌時間>14 min時，外植體并沒有全部死亡，均能成功誘導出愈傷組織，說明臭氧既能起到良好的殺菌作用，能減少升汞的滅菌時間從而降低其對外植體的損害。升汞滅菌10 min，雖然有少量的污染（污染率5%），但其愈傷組織誘導率最高（95%），愈傷組織后續(xù)生長良好。所以0.1% HgCl2和臭氧復合滅菌為最佳滅菌組合，最優(yōu)滅菌條件為臭氧滅菌30 min，0.1%HgCl2溶液滅菌10 min，獲得的愈傷組織呈淡黃色，質(zhì)地松散（圖1）。

2.4 殺菌劑和抗生素復合滅菌法對海南粗榧外植體污染與愈傷組織誘導的影響

由表4可知，殺菌劑和抗生素復合滅菌法對植物組織有較大傷害，外植體移接到培養(yǎng)基2～3 d后出現(xiàn)褐變死亡，最終全部死亡。說明殺菌劑和抗生素復合滅菌方法雖能殺死內(nèi)生菌，同時也傷害植物組織。

2.5 不同滅菌方法對嫩葉外植體細胞活性的影響

由圖2可知，三種滅菌方法對嫩葉外植體細胞活性存在明顯差異，臭氧與升汞復合滅菌法影響最小，升汞滅菌法次之，次氯酸鈉與升汞復合滅菌法影響最大；升汞單獨滅菌前17 min，細胞活力下降不明顯，細胞活力只下降8%，但滅菌20 min，活力下降29%，具顯著差異；升汞和次氯酸鈉聯(lián)合滅菌14 min后對植物細胞活力即有顯著差異，滅菌20 min后，其細胞活力下降60%；升汞與臭氧聯(lián)合滅菌有提高細胞活力的作用，盡管隨滅菌時間延長，活力出現(xiàn)下降趨勢，但不同滅菌時間對植物細胞活力無明顯差異。

3 討論與結(jié)論

TTC法驗證了不同滅菌方法對植物細胞活性的影響。升汞滅菌時間的延長使細胞活性逐漸降低，但17 min前無明顯差異，20 min才達到明顯差異，升汞使細胞活性下降的主要原因是使植物細胞蛋白質(zhì)變性，但植物組織對升汞的滲透性差，阻礙其作用，因此需有相應作用時間才能使細胞活性出現(xiàn)明顯下降。本試驗結(jié)果顯示，次氯酸鈉溶液對植物外植體造成較嚴重的傷害，短時間作用（14 min）就可使細胞活力出現(xiàn)明顯下降，造成愈傷組織誘導率低，效果最差。這可能與次氯酸鈉強烈的氧化作用及較好的組織滲透性有關(guān)，另外次氯酸鈉對植物材料特別是葉子有強的漂白作用。外植體經(jīng)過臭氧滅菌后細胞活力反而高于空白對照，可能與臭氧的護色作用作用有關(guān)。本試驗過程中發(fā)現(xiàn)，用次氯酸鈉滅菌時，植物脫色很厲害，植物馬上死亡，而臭氧處理的植物，顏色很鮮綠，活力高；其次TTC測定活力的原理是作為脫氫酶的受氫體被還原成為紅色物質(zhì)，因此植物細胞活性測定結(jié)果與其細胞內(nèi)的脫氫酶活性密切相關(guān)。植物中殘留的臭氧分子可能消耗脫氫酶產(chǎn)生的氫，從而使脫氫反應不斷進行，對脫氫酶有激活作用，其具體原因有待進一步研究。

消毒是組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)，組織培養(yǎng)中外植體消毒好壞直接影響到后續(xù)的研究。本試驗引入臭氧對熱帶植物外植體進行滅菌，臭氧具有殺菌迅速，可以彌散而均勻，殺菌無死角等特點。在75%酒精1 min，臭氧滅菌30 min，0.1% HgCl2溶液10 min時，可獲得較低的污染率（5%）與較高的愈傷組織誘導率（95%），解決了野生海南粗榧外植體污染嚴重的問題。

參考文獻

[1] 中國醫(yī)學科學院藥物研究所編著. 中草藥現(xiàn)代研究（第二卷）[M]. 北京： 北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1996： 143-128.

[2] 中國科學院植物研究所. 中國植物紅皮書-瀕危植物（第一冊）[M]. 北京： 科學出版社， 1992： 24.

[3] Zhang Wei， Bai Xuefang， Bu Zongshi， et al. Enhanced production of harringtonine and homoharringtonine in Cephalotaxus fortunei calli culture by periodic temperature oscillation[J]. Biotechnology Letters， 1998， 20（1）： 63-66.

[4] 符文英， 杜道林， 符木均. 海南粗榧愈傷組織的誘導和培養(yǎng)[J]. 植物生理學通訊， 2004， 2（40）： 34-36.

[5] 劉進平， 吳佳靜， 黃艷麗，等. 海南粗榧外植體滅菌與愈傷組織誘導[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技， 2010， 33（1）： 39-41.

[6] 趙春莉， 李金英. 植物組織培養(yǎng)中污染原因及其控制方法[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學， 2010， 35（6）： 11-13.

[7] 周俊輝， 周厚高. 植物組織中內(nèi)生細菌污染問題[J]. 廣西植物， 2003， 23（1）： 64-70.

[8] Leifert C， Wites WM. Contaminants of plant tissue cultures[J]. Int Assoe Plant Tissue Culture Newsl， 1990， 12（4）： 64-70.

[9] 朱廣廉. 植物組織培養(yǎng)中的外植體滅菌[J]. 植物生理學通訊，1996， 32（6）： 444-449.

[10] 虞水紅， 李愛國， 劉 培. 超臭氧消毒與臭氧消毒機的研制[J]. 中國醫(yī)學裝備， 2005， 1（2）： 38-39.

[11] 金雪梅， 付亞冰， 吳 波. 臭氧滅菌在藥品生產(chǎn)中的應用初探[J]. 中華醫(yī)藥雜志， 2003， 8（3）； 43-45.

[12] 周 鵬， 鄭學勤， 陳向明. 成齡番木瓜的快繁技術(shù)[J]. 熱帶作物學報， 1995， 16（2）： 66-69.

[13] Bistrichanov S， Haralampieva V， Kaloyanova N. Testing of different types of antibiotics against bacterial contamination in Hydrangea hortensis in vitro[J]. Bulgarian Journal of Agricultural Science， 1997， 3（6）： 749-753.

[14] Barrett C， Cassells AC. An evaluationof antibiotics for the elimination of Xanthomonas campestris pv.pelargonii（Brown） from Pelargonium domesticumcv. ‘Grand Slamexplants in vitro[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 1994， 36（2）： 169-175.

[15] 翟建中， 顧梅俏. 長春蔓組培生產(chǎn)中污染的防除[J]. 森林病蟲通訊， 1999（4）： 30-32.

[16] 肖顯華， 王順珍，林榮雙. 植物材料表面消毒方法的改進[J]. 生物技術(shù)， 1999， 9（1）： 43-45.

[17] 王秀琴， 鄭 群. 不同藥劑處理對柴胡種子活力的影響[J]. 種子， 2002（2）： 23-24.

責任編輯：古小玲