根癌農(nóng)桿菌介導ACS反義基因轉化香蕉的研究

黃玉吉 賴鐘雄 林玉玲 陳裕坤

摘 要 以香蕉（Musa spp.）品種‘天寶蕉（Musa spp.，AAA類群）為試材，對以根癌農(nóng)桿菌介導法的香蕉遺傳轉化體系進行較全面的研究，并以該系統(tǒng)進行了ACS反義基因轉化香蕉的研究。結果表明：不經(jīng)預培養(yǎng)的香蕉莖尖橫切薄片，侵染前用附加0.1 mg/L甘露醇的高滲固體培養(yǎng)基前處理4 h，農(nóng)桿菌重懸液濃度為OD600在1.0左右，重懸液中含100 g/L蔗糖，接菌時間為10～15 min，于26 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)4 d，共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值為5.8是較為適合的轉化條件；采用附加100 mg/L卡那霉素、2 mg/L AgNO3篩選培養(yǎng)基對共培養(yǎng)后的香蕉橫切薄片進行篩選，共獲得5個轉ACS反義基因的抗性芽系；經(jīng)GUS組織化學法及PCR檢測，gus基因已整合進香蕉基因組。

關鍵詞 香蕉；橫切薄片；根癌農(nóng)桿菌；ACS反義基因；轉化

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

Transformation of Antisense ACS Gene to Banana Mediated

by Agrobacterium tumefaciens

HUANG Yuji， LAI Zhongxiong *， LIN Yuling， CHEN Yukun

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract A high efficiency and systematic transgenic procedure mediated by Agrobacterium was developed in Musa spp. cv. Tianbaojiao（AAA group）. The introduction of antisense ACS gene to banana was conducted，and the optimized parameters used in Agrobacterium-mediated transformation were obtained. The best transient expression of GUS was obtained under the conditions as follows：the thin cross-sections which were not precultured but were pretreated with 0.1 mol/L mannitol for 4 h，and the Agrobacterium suspension was with OD600 value of 1.0 and supplemented with 100 g/L sucrose，the samples were infected for 10～15 mins，and then they were transferred onto the non-selective medium（pH5.8）supplemented with 0.1 mg/L NAA and 1.0 mg/L BA for co-culture for 4 days at 26 ℃ in the dark. After co-culture，the thin cross-sections were selected on MS medium supplemented with 100 mg/L kanamycin and 2 mg/L AgNO3，which could be used to inhibit Agrobacterium contamination and be good for bud differentiation. At last，5 resistant bud lines were maintained for further studies. The GUS histochemical and PCR assays proved that the gus gene had integrated into the genome of the 5 resistant bud lines.

Key words Banana； Thin-cross-section； Agrobacterium-mediated； Antisense ACS gene； Transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.004

在果實延熟保鮮上，廣泛采用的氣調(diào)貯藏或使用保鮮劑等方法所能保鮮的時間非常有限，而且成本很高。ACS催化S-腺苷蛋氨酸向乙烯轉化，是植物體內(nèi)乙烯生物合成的關鍵酶?？赏ㄟ^反義RNA技術控制ACS基因表達抑制乙烯生物合成，提高果實耐貯性能。至今為止，在番茄[1-4]、煙草[5]、西瓜[6]、河套蜜瓜[7]、番木瓜[8]、梨[9]上都進行了該基因的轉化工作，研究結果都表明，ACS反義基因的導入確實能不同程度的抑制乙烯的生成。香蕉為呼吸躍變型果樹，若實現(xiàn)該基因的轉化將具有重要意義。雖香蕉屬單子葉植物，但隨農(nóng)桿菌侵染機理的深入研究和揭示，采用相應的技術措施，農(nóng)桿菌介導的香蕉基因轉化也取得了一定進展。Gregory等[10]首先報道了通過農(nóng)桿菌介導實現(xiàn)外源基因對香蕉（Musa spp.）的轉化，隨后研究者們展開了一系列相關研究，Ganapathi[11]、Mo/ller-Nielsen[12]、陳廷速[13]、黃霞[14]和張妙霞[15]等進行了農(nóng)桿菌介導的香蕉轉化技術的探索和相關基因的轉化研究。本研究擬采用根癌農(nóng)桿菌介導法將ACS反義基因導入香蕉，抑制乙烯的生物合成，有望培育出果實耐貯運的新品種，從根本上解決香蕉采后貯藏保鮮問題。

1 材料與方法

1.1 材料

轉化受體材料為天寶蕉低代試管苗莖尖橫切薄片，由福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所所保存。同一組試驗中外植體供體植株的培養(yǎng)代數(shù)和培養(yǎng)時間均相同。根癌農(nóng)桿菌菌株為LBA4404，植物表達載體為pBI121，含有gus報告基因、卡那霉素抗性篩選基因和ACS反義基因，由中國農(nóng)業(yè)大學李建生教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 轉化 挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于含100 mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基，28 ℃，120 r/min（HZQ-C空氣浴振蕩器，下同）振蕩培養(yǎng)過夜，即活化菌液，將培養(yǎng)好的菌液在4 500 r/min（TGL-16C普通離心機，轉子型號為F 1010）下離心10 min，后用MS+100 g/L 蔗糖的液體培養(yǎng)基重懸菌體，然后將薄片外植體移入準備好的菌液中，在28 ℃，120 r/min條件下振蕩數(shù)分鐘，取出薄片后置于MS+1.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA固體培養(yǎng)基上，于26 ℃下共培養(yǎng)（暗培養(yǎng)）4 d。然后用頭孢霉素無菌水（含300 mg/L頭孢霉素）除去薄片表面的農(nóng)桿菌，后轉移到篩選培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L AgNO3+100 mg/L kan上進行抗性篩選，篩選2個月。

對于轉化因素的研究共設計了以下9組試驗：

（1）共培養(yǎng)時間（2、3、4、5、6、7 d）；

（2）農(nóng)桿菌重懸液濃度（OD600值分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4）；

（3）農(nóng)桿菌重懸液中蔗糖濃度（分別為30、50、100、150 g/L）；

（4）農(nóng)桿菌接菌時間（5、8 、10 、15 、30 、60 min）；

（5）外植體預培養(yǎng)（①不經(jīng)預培養(yǎng)，②預培養(yǎng)1 d，③預培養(yǎng)2 d）；

（6）外植體前處理（①不經(jīng)前處理，②在附加有0.1 mol/L甘露醇的液體培養(yǎng)液中，120 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，③在附加有0.1 mol/L甘露醇的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h）；

（7）共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值（pH分別為5.4、5.8、6.2、7.0）；

（8）共培養(yǎng)溫度（24、26、28、30 ℃）；

（9）薄片外植體的生理狀態(tài)（切取不同位置的香蕉薄片，按所取外植體與球莖頂端的距離由近到遠，編號為1-4，分別進行轉化）。

以上9組處理中，除需試驗的因素外其他轉化條件均一致，且通過GUS瞬時表達情況確定本系統(tǒng)最適合的轉化條件。

1.2.2 GUS組織化學法檢測 香蕉莖尖薄片經(jīng)農(nóng)桿菌侵染，共培養(yǎng)4 d除菌后，取薄片于微量離心管中，加適量的X-Gluc工作液，置于37 ℃黑暗條件下保溫4 h，于顯微鏡下觀察染色情況，每個處理各取30片，3個重復，統(tǒng)計出現(xiàn)藍斑的薄片數(shù)，計算其百分率。

1.2.3 抗性芽的篩選與繼代增殖 香蕉橫切薄片的篩選主要采用直接篩選法。30 ℃黑暗條件下進行篩選培養(yǎng)，篩選2個月，每隔10 d左右將香蕉轉移至相同配方的新鮮篩選培養(yǎng)基上，同時剔除褐變死亡以及白化的小芽。將選擇培養(yǎng)所獲得的抗性芽轉入分化培養(yǎng)基中進行繼代擴繁培養(yǎng)，以形成叢芽。各繼代周期中培養(yǎng)條件保持一致，培養(yǎng)室溫度控制在（26±2）℃，光照強度為1 000 lx，光照時間為12 h/d。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將擴繁得到的叢芽分成單芽，接種到含有選擇壓的生根培養(yǎng)基（無激素的MS培養(yǎng)基）上進行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上。

1.2.5 抗性再生幼苗的移栽 待抗性再生幼苗長至具有3～4片展開的葉片并帶有5～8條健壯的不定根時，打開瓶蓋煉苗7 d。后將附著于根部的培養(yǎng)基用無菌水洗凈，移栽于消毒過的泥炭土中。開始1～2周用罩子罩住幼株，防止水分蒸發(fā)，保持較高濕度，此后逐漸降低濕度與正常濕度條件一致，在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 再生植株的GUS組織化學法檢測 將香蕉再生植株的葉片剪下，放入1.5 mL微量離心管中，然后加適量的X-Gluc工作液，置于37 ℃黑暗條件下保溫4 h；取出材料，用75%乙醇漂洗脫色，至陰性對照材料呈白色為止；于顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.7 gus基因的PCR檢測 采用CTAB法提取香蕉總DNA，gus基因引物由上海生工合成，引物引物序列為5′-GCTATACGCCATTTGAAGCC-3′和5′-TTGACTGCCTCTTCGCTGTA-3′。PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 GUS瞬時表達檢測時間的選擇

共培養(yǎng)時間對GUS瞬時表達率的影響見表1。由表1可看出，共培養(yǎng)2 d時瞬時表達率較低，當共培養(yǎng)3～4 d時瞬時表達率明顯提高，隨后GUS活性逐漸衰退，到7 d時降為10.54%。3次重復試驗的結果都顯示共培養(yǎng)4 d時香蕉薄片的GUS瞬時表達活性最高，而未被侵染的對照薄片始終無GUS表達。因此，選擇4 d為此轉化試驗的共培養(yǎng)時間。

2.2 農(nóng)桿菌重懸液濃度對GUS瞬時表達的影響

農(nóng)桿菌重懸液濃度對GUS瞬時表達率的影響見表2。由表2可看出，隨著重懸液濃度的上升，瞬時表達率也升高；但當重懸液濃度超過到OD600在1.0后，瞬時表達率開始下降?？梢姡簼舛冗^高或過低，轉化效率都有所下降。

2.3 農(nóng)桿菌重懸液中蔗糖濃度對GUS瞬時表達的影響

農(nóng)桿菌重懸液中蔗糖濃度對GUS瞬時表達率的影響見表3。表3列出了不同蔗糖濃度（30、50、100、150 g/L）下，GUS瞬時表達情況。可以看出，當農(nóng)桿菌重懸液中蔗糖濃度達100 g/L時，香蕉薄片的GUS基因瞬時表達最好，達41.90%。

2.4 農(nóng)桿菌接種時間對GUS瞬時表達的影響

農(nóng)桿菌介導植物轉化時，必須將菌液與植物材料進行一定時間的混合培養(yǎng)，使農(nóng)桿菌接種到植物細胞表面，接菌時間的長短對轉化效率的影響比較大。結果如表4所示，當接菌時間為10～15 min時，GUS表達率較高；當超過30 min后，其表達率明顯下降；接菌60 min時，其瞬時表達率只為9.18%。這可能是香蕉薄片外植體在菌液中浸泡時間過長而受到過大的毒害造成的。

2.5 外植體預培養(yǎng)對GUS瞬時表達的影響

一般認為外植體在轉化前進行預培養(yǎng)，不僅促進細胞分裂，而且利于傷口的酚類物質(zhì)釋放與積累、T-DNA轉移并整合到植物細胞基因組，從而提高外源基因的瞬時表達和轉化率。但本試驗的結果卻是不經(jīng)預培養(yǎng)的薄片轉化的瞬時表達率最高，預培養(yǎng)1 d的薄片瞬時表達率次之，預培養(yǎng)2 d的最低（表5）。

2.6 外植體前處理對GUS瞬時表達的影響

為進一步提高農(nóng)桿菌侵染外植體的效率，進行了外植體的前處理試驗，結果如表6所示，外植體于MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L BA+0.1 mol/L甘露醇（固）高滲處理4 h后再接種農(nóng)桿菌，其瞬時表達率最高，達40.05%。高滲處理使細胞失水，形成內(nèi)高外低的滲透壓梯度，有利于植物細胞在極短的時間內(nèi)吸收其周圍的農(nóng)桿菌懸濁液，從而提高轉化率。

2.7 共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值對GUS瞬時表達的影響

一般認為偏酸性的培養(yǎng)條件有利于農(nóng)桿菌vir基因的表達，但也有人認為pH7.0有利于轉化，原因是適合農(nóng)桿菌的pH值為7.0，可縮短共培養(yǎng)時間，減輕農(nóng)桿菌對材料的毒害，從而有利于材料的恢復生長。本研究的結果是，在pH7.0時，瞬時表達率較低，而且pH7.0也不適合植物生長。同時，從表7可以看出，pH5.8時瞬時表達率最高。因此，確定pH5.8為本系統(tǒng)的適合pH值。

2.8 共培養(yǎng)溫度對GUS瞬時表達的影響

由試驗結果（表8）可知，在香蕉的轉化中，共培養(yǎng)溫度在26 ℃時，GUS瞬時表達率最高，在24 ℃時差異不大，其余幾個溫度的GUS瞬時表達率都明顯低于24和26 ℃。說明共培養(yǎng)溫度對香蕉的轉化有一定影響的，26 ℃是本試驗發(fā)現(xiàn)的香蕉轉化最佳的共培養(yǎng)溫度。

2.9 薄片外植體的生理狀態(tài)對GUS瞬時表達的影響

外植體的生理狀態(tài)是轉化試驗能否成功的關鍵所在。由表9可看出，外植體越靠近根部，其瞬時表達率也越高。編號為1的外植體，轉化時瞬時表達率最高，可達46.66%；另外，優(yōu)化受體系統(tǒng)試驗結果也表明香蕉莖尖頂端分生組織（即編號為1的薄片）出芽率最高。因此選擇香蕉的頂端分生組織橫切薄片作為本研究中農(nóng)桿菌侵染的直接受體。

2.10 香蕉抗性芽篩選情況

將農(nóng)桿菌感染過的香蕉橫切薄片接到篩選培養(yǎng)基上，篩選2個月。隨著篩選的進行，大部分的抗性芽生長正常；而一些白化的抗性芽生長到一定階段就逐漸黃化，后停止生長至最終死亡；還有一些抗性芽長出的葉片無法轉綠，成為黃化體（圖1）。經(jīng)過篩選，最終分別獲得5個轉ACS反義基因的抗性芽，抗性芽分化率為22.01%。

2.11 香蕉轉基因植株再生

抗性芽轉移到含有抗生素的生根培養(yǎng)基，1周后開始長根，3周后長成完整的健壯植株。大部分植株形態(tài)與未轉化的香蕉植株無異，有少數(shù)嵌合體植株，即葉片不是呈正常的綠色，在同一植株中，部分葉片呈黃綠色，部分葉片呈綠色；在同一片葉子中也會出現(xiàn)黃綠相間的顏色（圖1）。

2.12 香蕉轉基因植株的移栽

生根后的植株經(jīng)煉苗后移栽于消毒好的泥炭土中，移栽成活率可達90%以上，長勢良好，如圖1中F所示。

2.13 轉基因再生植株組織化學法檢測

香蕉抗性芽再生植株的葉片，進行組織化學法染色，結果顯示，香蕉抗性芽中的表達GUS的陽性克隆得到的再生植株的葉片切口被染成藍色，葉片在X-Gluc工作液中浸泡過夜之后顏色變成淺黃綠色，有的葉片中有藍斑出現(xiàn)；有的葉片只有橫切面上被染成藍色，葉片內(nèi)部未發(fā)現(xiàn)染色（圖2）。綜上所述，可以初步確定這些再生植株為轉基因植株。

經(jīng)X-Gluc溶液染色檢驗為非陽性的抗性芽產(chǎn)生的再生植株的葉片再進行X-Gluc溶液染色仍未發(fā)現(xiàn)有藍斑出現(xiàn)，說明這些抗性芽中確實沒有GUS表達。

2.14 轉基因再生植株葉片gus基因PCR檢測

對轉化ACS反義基因的香蕉抗性芽再生的5 個株系葉片的gus基因的PCR檢測結果顯示，未轉化植株（陰性對照）沒有條帶出現(xiàn)，質(zhì)粒DNA（陽性對照）和5個轉基因再生株系都有明顯可見條帶（圖3）?？梢?，gus基因已經(jīng)整合進香蕉基因組中。

3 討論與結論

隨著農(nóng)桿菌侵染機理的深入研究，農(nóng)桿菌介導禾谷類等單子葉植物基因轉化已獲得成功。雖然與雙子葉植物相比，農(nóng)桿菌介導的單子葉植物的遺傳轉化仍存在著相當大差距，但只要建立高效的轉基因受體系統(tǒng)、選擇合適的菌株、采用相適應的轉化條件，是可以獲得較高的轉化效率的。而酚類化合物如乙酰丁香酮（AS）或羥基乙酰丁香酮（OH-AS）等被證明是vir基因的天然誘導劑。香蕉是單子葉植物，在農(nóng)桿菌介導的香蕉遺傳轉化研究中也有采用AS等來提高轉化效率的相關報道[11，13，16]。但本試驗并未采用AS作為vir基因的誘導劑，香蕉薄片的GUS瞬時仍然較高，最高可達46.66%。這可能是不同果樹或同一果樹不同基因型，或者是不同添加方式、不同的培養(yǎng)基成分對AS的敏感程度不同造成的。故筆者認為AS在香蕉轉化中并不是必需的。

掌握合適的菌液接種濃度及外植體在菌液中浸泡的時間，有助于提高轉化效率并兼顧到后續(xù)的除菌。菌液濃度太低或浸泡時間太短，接種到傷口面的農(nóng)桿菌數(shù)量太少，在共培養(yǎng)時轉化效率低；菌液濃度過高或浸泡時間過長，常導致農(nóng)桿菌繁殖過度，受體材料因毒害缺氧而軟腐，降低轉化效率，而且農(nóng)桿菌和植物細胞的結合位點是有限的，當農(nóng)桿菌濃度過大時，由于競爭激烈，反而不利于農(nóng)桿菌與植物細胞的結合，從而也降低了轉化效率。

共培養(yǎng)時間對轉化效率也有很大影響，不同轉化材料或不同菌株類型所需的最佳共培養(yǎng)時間不同。共培養(yǎng)時間過短，農(nóng)桿菌尚未附著，T-DNA還沒有充分切割、轉移和整合；時間過長，植物細胞易受毒害，后續(xù)培養(yǎng)時難以除菌，農(nóng)桿菌容易過度生長。對于共培養(yǎng)溫度這一因素，存在著25 ℃[17]、22 ℃[18]甚至20 ℃[19]不一致的研究結果。而本試驗通過GUS瞬時檢測認為，26 ℃是農(nóng)桿菌轉化香蕉的適合溫度。這其中可能涉及到T-DNA轉移的最適溫度，vir基因的誘導和外源片段整合及穩(wěn)定表達需要的溫度，以及植物細胞也可能存在著接受農(nóng)桿菌轉化的最適溫度等，這些都需要從更深層次的作用機理方面進一步探索。

本研究得到的轉化體中除了正常的轉化體外，還存在白化和黃化現(xiàn)象，以及嵌合體現(xiàn)象。這些異?，F(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是農(nóng)桿菌T-DNA整合進植物基因組時造成編碼葉綠素的基因突變或缺失，致使植物細胞葉綠素合成受阻或葉綠體異常。

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責任編輯：葉慶亮