啤酒廢水培養(yǎng)螺旋藻的研究啤酒廢水培養(yǎng)螺旋藻的研究

柳青 張端 賀亞龍 張景來

摘要[目的]研究啤酒廢水培養(yǎng)螺旋藻的可行性。[方法]利用啤酒廢水培養(yǎng)螺旋藻，研究不同廢水濃度下螺旋藻的生長狀況及其對(duì)廢水中氮、磷、有機(jī)質(zhì)的去除效率，以及在放大培養(yǎng)時(shí)螺旋藻的生物量、蛋白質(zhì)和脂肪含量。[結(jié)果]螺旋藻可在啤酒廢水中生存，且啤酒廢水有緩沖培養(yǎng)液pH增加的作用，能使螺旋藻更長時(shí)間處于適宜生存的狀態(tài)。50%啤酒廢水、50%Zarrouk培養(yǎng)液最適宜螺旋藻生長，且產(chǎn)量達(dá)到最大。同時(shí)，螺旋藻可對(duì)啤酒廢水產(chǎn)生凈化作用。螺旋藻對(duì)100%啤酒廢水中有機(jī)質(zhì)、總氮、總磷的去除效率分別可達(dá)55.95%、77.78%和42.62%。在最佳配比濃度條件下，放大培養(yǎng)的產(chǎn)藻量為0.794 g/L，蛋白質(zhì)和脂肪含量分別達(dá)到69.5%和8.11%。[結(jié)論]該研究可使污水凈化和螺旋藻利用相結(jié)合，達(dá)到環(huán)境與經(jīng)濟(jì)效益的統(tǒng)一。

關(guān)鍵詞螺旋藻；啤酒廢水；去除率；產(chǎn)藻量

中圖分類號(hào)X797文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）01-00054-03

作者簡介柳青（1990- ），女，安徽阜陽人，碩士研究生，研究方向：資源經(jīng)濟(jì)學(xué)，Email：irisliuqing@163.com。

收稿日期20131212近些年，由于工業(yè)企業(yè)將大量富含高營養(yǎng)物質(zhì)的工業(yè)廢水排放到自然水體中，引發(fā)了嚴(yán)重的水體富營養(yǎng)化問題，赤潮、水華頻發(fā)。尋找一種經(jīng)濟(jì)有效處理工業(yè)廢水的方法是當(dāng)務(wù)之急。該試驗(yàn)試圖利用能在較高營養(yǎng)物質(zhì)及嚴(yán)苛的生存條件下生存并對(duì)廢水進(jìn)行處理的螺旋藻，使污水凈化和利用相結(jié)合，達(dá)到環(huán)境與經(jīng)濟(jì)效益的統(tǒng)一。

螺旋藻是目前常用微藻（小球藻、綠藻、螺旋藻）中蛋白質(zhì)含量最高、營養(yǎng)最全面的藻種，它的蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%～70%，是小球藻的1.5倍[1]。螺旋藻生長所需pH高（pH 9～11），一般雜菌難以在其培養(yǎng)液中生長，可采用直接接種進(jìn)行培養(yǎng)[2]。啤酒廢水富含有機(jī)物質(zhì)和氮、磷等成分，其化學(xué)需氧量（COD）可達(dá)到10 000 mg/L以上，未經(jīng)處理直接排放會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，普通啤酒廢水處理的成本又很高。螺旋藻具有培養(yǎng)條件簡便、繁殖速度快、對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)以及高蛋白質(zhì)高脂肪含量等特點(diǎn)，如果可以大規(guī)模利用啤酒廢水養(yǎng)殖螺旋藻，將是一個(gè)低費(fèi)用、高效益的處理廢水的方法，同時(shí)能夠?yàn)樯镔|(zhì)油的制造提供良好原料。筆者利用啤酒廠廢水培養(yǎng)螺旋藻，研究了不同廢水濃度下螺旋藻的生長狀況及其對(duì)廢水中氮、磷、有機(jī)質(zhì)的去除效率，以及在放大培養(yǎng)時(shí)螺旋藻的生物量、蛋白質(zhì)和脂肪含量。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料Zarrouk培養(yǎng)基：NaHCO316.80 g/L，NaCl 1.00 g/L，K2HP O40.50 g/L，NaNO3 2.50 g/L，K2SO4 1.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，CaCl2·2H2O 0.04 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，Na2EDTA 0.08 g/L[2]。A5溶液：H3BO3 2.86×10-3 g/L，MnCl2·4H2O 1.81×10-3 g/L，ZnSO4·7H2O 0.22×10-3 g/L，CuSO4·5H2O 0.079×10-3 g/L，MoO3 0.015×10-3 g/L。B6溶液：NH4VO3 22.9×10-6 g/L，NiSO4·7H2O 47.8×10-6 g/L，Co（NO3）2·6H2O 4.4×10-6 g/L，NaWO4 17.9×10-6 g/L，TiSO4 40.0×10-6 g/L。

1.2試驗(yàn)方法試驗(yàn)利用過濾（抽濾法）后的啤酒廢水和Zarrouk培養(yǎng)液按照不同配比混合培養(yǎng)：①按照啤酒廢水含量0%、25%、50%、75%、100%與Zarrouk試劑進(jìn)行混合，每個(gè)濃度設(shè)計(jì)兩個(gè)平行樣本，總計(jì)10個(gè)試樣；②添加營養(yǎng)元素進(jìn)行培養(yǎng)：用硝酸鹽代替氮元素，而鈣離子和鎂離子則由自來水直接提供；③用250 ml錐形瓶于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2 000 xl，溫度30 ℃，每隔3 h晃動(dòng)一次，光暗周期為12 h∶12 h。

1.3螺旋藻生物量該試驗(yàn)使用鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis），購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所。采用分光光度法測(cè)定螺旋藻生物量。在每天的相同時(shí)間利用分光光度計(jì)測(cè)定各螺旋藻樣品在560 nm波長處的吸光度，根據(jù)得到的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到對(duì)應(yīng)的螺旋藻濃度，以了解螺旋藻的生長情況。比增長速率（R）根據(jù)以下公式計(jì)算：R=ln（x2/x1）/（t2-t1）。式中， x1為初始時(shí)的藻現(xiàn)存量；x2為結(jié)束時(shí)的藻現(xiàn)存量；t1為測(cè)定x1的日期；t2為測(cè)定x2的日期。

1.4培養(yǎng)液分析測(cè)定項(xiàng)首先，對(duì)啤酒廢水水質(zhì)進(jìn)行分析，主要目的是測(cè)定螺旋藻對(duì)啤酒廢水中以下指標(biāo)的去除率，因此測(cè)定培養(yǎng)液在培養(yǎng)螺旋藻前后的總氮、總磷、COD以及pH的變化情況。培養(yǎng)液pH：利用pH快速測(cè)定儀測(cè)定5、10、15 d錐形瓶中藻液的pH以了解螺旋藻的生長環(huán)境。總磷的測(cè)定：采用鉬酸銨分光光度法，利用721分光光度計(jì)測(cè)定5、10、15 d的培養(yǎng)液總磷?？偟臏y(cè)定：采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定5、10、15 d的培養(yǎng)液總氮。COD的測(cè)定：采用快速消解分光光度法，利用COD快速消解儀測(cè)定5、10、15 d的培養(yǎng)液COD。

然后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。由不同濃度配比的混合液中螺旋藻的生長情況得到最佳配比，在大缸中進(jìn)行相對(duì)大規(guī)模培養(yǎng)。最后對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過測(cè)定其蛋白質(zhì)、脂肪含量，了解螺旋藻的生長情況和未來合成生物質(zhì)油的潛力。由恒溫箱培養(yǎng)得到50%啤酒廢水和50%Zarrouk培養(yǎng)液的比例下，螺旋藻的生長效果最好。因此以該比例放大培養(yǎng)，采用30 L啤酒廢水和30 L Zarrouk培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，接種比例為1∶12.5，光照強(qiáng)度2 000 xl，溫度30 ℃，光暗周期為12 h∶12 h。在大缸中放置兩個(gè)恒溫加熱器和一個(gè)循環(huán)機(jī)以保持微藻的生長均勻。對(duì)培養(yǎng)所得的藻體進(jìn)行處理，稱取干重。收集50 ml藻體于篩絹上，于60 ℃烘干至恒重，冷卻后稱量，計(jì)算產(chǎn)藻量。最后進(jìn)行產(chǎn)物分析，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，利用索氏提取器提取脂肪進(jìn)行測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1恒溫箱培養(yǎng)

2.1.1生物量測(cè)定。對(duì)試驗(yàn)獲得的干藻粉進(jìn)行生物量測(cè)定。稱取干燥后的藻粉，配制成5 g/L的藻液，利用超聲波使干藻粉充分溶解，搖勻。精確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml藻液于10只比色管中，加蒸餾水至50 ml標(biāo)線，搖勻。利用721分光光度計(jì)在560 nm處測(cè)定其吸光度，得到螺旋藻吸光值與藻細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別配制0%、25%、50%、75%、100%的啤酒廢水-Zarrouk培養(yǎng)液，做平行試驗(yàn)，以0A、0B、25A、25B、50A、50B、75A、75B、100A、100B標(biāo)記（75A表示啤酒廢水含量為75%，Zarrouk培養(yǎng)液含量為25%的平行試驗(yàn)1組）。每日測(cè)定其吸光度，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中找出對(duì)應(yīng)的螺旋藻濃度，結(jié)果如表1所示。在15 d的培養(yǎng)周期內(nèi)，螺旋藻濃度呈逐漸增加的趨勢(shì)。在接種初期，由于接種量較低、光強(qiáng)較強(qiáng)，細(xì)胞生長出于遲滯狀態(tài)。此后，細(xì)胞逐漸進(jìn)入指數(shù)生長期，個(gè)體數(shù)量迅速增加，但在大約13 d后，生長速度變緩，進(jìn)入了生長的穩(wěn)定期。

2.1.2培養(yǎng)液性質(zhì)測(cè)定。

2.1.2.1pH。由于pH的測(cè)定過程耗時(shí)較長，且每天的pH相差不大，整體變化情況比較穩(wěn)定，所以每5 d測(cè)定一次pH，利用pH快速測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。由表2可知，pH呈逐漸上升趨勢(shì)。因?yàn)殡S著藻細(xì)胞濃度的增加，對(duì)無機(jī)碳的利用也隨之加強(qiáng)，pH呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。隨著廢水濃度的增加，pH升高的趨勢(shì)變緩。由此可見，添加了啤酒廢水對(duì)培養(yǎng)液的pH起到緩沖作用，使之升高速度減慢，從而延長了適宜螺旋藻生長的時(shí)間。因此在培養(yǎng)液中適當(dāng)添加廢水有助于螺旋藻的生長。

2.1.2.2總磷。利用鉬酸銨分光光度法測(cè)定總磷。用甲苯做萃取劑，萃取水樣中的單質(zhì)磷。萃取液經(jīng)溴酸鉀-溴化鉀溶液將單質(zhì)磷氧化成正磷酸鹽，在酸性條件下，正磷酸鹽與鉬酸銨反應(yīng)生成的磷鉬雜多酸被還原劑氯化亞錫還原成藍(lán)色絡(luò)合物，其吸光度與單質(zhì)磷的含量成正比，用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，計(jì)算單質(zhì)磷的含量。按照鉬酸銨分光光度法的步驟，繪制得到磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。培養(yǎng)液中總磷濃度由0.962 mg/L下降到0.052 mg/L，去除率為42.62%，去除效果較好。

2.1.2.3總氮。采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定總氮。在60 ℃以上水溶液中，過硫酸鉀可分解產(chǎn)生硫酸氫鉀和原子態(tài)氧，而硫酸氫鉀在溶液中離解產(chǎn)生氫離子，故在氫氧化鈉的堿性介質(zhì)中可促使分解過程趨于完全。分解出的原子態(tài)氧在120～124 ℃條件下可使水樣中含氮化合物的氮元素轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，并且在該過程中有機(jī)物同時(shí)被氧化分解?？捎米贤夥止夤舛确ㄓ诓ㄩL220和275 nm處，分別測(cè)出吸光度A220及A275，按下式求出校正吸光度A：A=A220-2A275。按吸光度A值比較標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算總氮（以NO3N計(jì)）含量。由于啤酒廢水原始含氮量較高，超過該方法的量程，故對(duì)原水進(jìn)行了稀釋，根據(jù)工作曲線得到了相應(yīng)的濃度數(shù)據(jù)。在恒溫箱培養(yǎng)之前以及培養(yǎng)5、10和15 d測(cè)定100%啤酒廢水的總氮含量分別為11.7、8.9、5.3和2.6 mg/L?？梢姡【茝U水總氮含量較高，達(dá)到了11.7 mg/L，而經(jīng)過螺旋藻的生長和繁殖，廢水經(jīng)過凈化，最終的總氮濃度達(dá)到了2.6 mg/L，大幅度的減少，去除率達(dá)到了77.78%。

2.1.2.4COD。采用重鉻酸鉀分光光度法測(cè)定COD。在一定條件下，經(jīng)重鉻酸鉀氧化處理，水樣中的溶解性物質(zhì)和懸浮物所消耗的重鉻酸鉀相應(yīng)于氧的質(zhì)量濃度，1 mol重鉻酸鉀（1/6 K2Cr2O7 ）相當(dāng)于 1 mol氧（1/2 O）。試樣中加入已知量的重鉻酸鉀溶液，在強(qiáng)硫酸介質(zhì)中，以硫酸銀作為催化劑，經(jīng)高溫消解后，用分光光度法測(cè)定COD值。在進(jìn)行對(duì)COD去除效果的測(cè)定工作時(shí)，由于使用的是哈希PC MultiDirect分光光度計(jì)進(jìn)行分析讀數(shù)，校準(zhǔn)之后的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.395 9 x+11.593 8，R2=0.999 3，擬合度較高，表示替換藥品的方法可行。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)之前以及培養(yǎng)5、10、15 d測(cè)定培養(yǎng)液的COD含量分別為163.9、143.9、105.2和72.2 mg/L?？梢娬麄€(gè)培養(yǎng)周期，螺旋藻對(duì)COD的去除率為55.95%。通過用啤酒廢水培養(yǎng)螺旋藻，啤酒廢水中的有機(jī)物含量大幅下降。

2.2擴(kuò)大培養(yǎng)

2.2.1產(chǎn)藻量的測(cè)定。抽取50 ml螺旋藻液，體積記為V，用500目的雙層篩絹進(jìn)行過濾。過濾前稱量篩絹的質(zhì)量為72.381 9 g，記為m1，過濾之后在60 ℃下烘干篩絹與螺旋藻至恒重，取出待冷卻后，稱量其質(zhì)量，為72.421 6 g，記為m2。在50%啤酒廢水與50%Zarrouk培養(yǎng)基的條件下，螺旋藻的產(chǎn)藻量達(dá)到了0.794 g/L。即使沒有添加培養(yǎng)基的純污水也能培養(yǎng)并收獲一定量的螺旋藻。

2.2.2產(chǎn)物分析。

2.2.2.1蛋白質(zhì)含量。在各個(gè)不同配比的標(biāo)準(zhǔn)試樣中加入考馬斯亮藍(lán)G-250之后，顯色2 min以上，利用721分光光度計(jì)在595 nm波長處測(cè)定其吸光度，將第1組作為空白背景值扣除。根據(jù)蛋白質(zhì)含量不同對(duì)應(yīng)著不同的吸光度值，可以做出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：利用500目的篩絹對(duì)螺旋藻液進(jìn)行過濾，用清水反復(fù)沖洗至中性，過濾后將篩絹置于60 ℃恒溫箱中烘干至恒重。稱取0.1 g干藻粉，加入100 ml蒸餾水，在-20和37 ℃反復(fù)凍融3～4次。最后一次融化后，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速在離心機(jī)里轉(zhuǎn)10 min，取上清液測(cè)量其蛋白質(zhì)含量。最后取0.1 ml的上清液，用蒸餾水稀釋至1 ml，加入5 ml G250試劑，顯色2 min以上，測(cè)其吸光度A=1.378。根據(jù)擬合曲線方程，求得測(cè)定的0.1 ml上清液中有蛋白質(zhì)m1=69.5 μg。X=m1/V2×V1/m=69.5/0.1×1/0.1×100%=69.5%。其中，X為干藻粉的蛋白質(zhì)含量，%；m1為上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，μg；V1為上清液的總體積， ml；V2為提取上清液的體積， ml；m為干藻粉總重量，g。最終得到螺旋藻的蛋白質(zhì)含量為69.5%，相對(duì)較高。這說明利用啤酒廢水和Zarrouk培養(yǎng)基聯(lián)合培養(yǎng)的螺旋藻生長情況良好，蛋白質(zhì)含量在正常范圍之內(nèi)。

2.2.2.2脂肪含量。將樣品預(yù)先在乙醚溶劑中浸泡一定時(shí)間，使部分油脂在乙醚溶劑中浸出，再采用索氏提取法，以乙醚為溶劑，在60～80 ℃的溫度條件下進(jìn)行脂肪抽提。利用脂肪能溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，在索氏提取器中將樣品用無水乙醚或石油醚等溶劑反復(fù)萃取，提取樣品中的脂肪后，蒸去溶劑，所得的物質(zhì)即為脂肪或稱粗脂肪。X=（m1-m0）/m×100%=（112.690 1-112.527 9）/2×100%=8.11%。其中，X為樣品中粗脂肪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；m1為脂肪和脂肪燒瓶的質(zhì)量，g；m0為脂肪燒瓶的質(zhì)量，g；m為樣品的質(zhì)量，g?？梢?，該次大缸培養(yǎng)得到的螺旋藻的脂肪含量大約為8.11%，屬于螺旋藻脂肪含量的正常范圍。

3結(jié)論

（1）螺旋藻可以在經(jīng)過一定處理的啤酒廢水中生長，即使沒有添加任何營養(yǎng)成分也可以成活，能夠做到污水全培養(yǎng)。

（2）螺旋藻在50%啤酒廢水、50%培養(yǎng)液的條件下培養(yǎng)，比增長速率最大，生長量最高。

（3）啤酒廢水起到緩沖培養(yǎng)液pH增加的作用，能使螺旋藻更長時(shí)間處于適宜生存的狀態(tài)。

（4）螺旋藻對(duì)啤酒廢水的有機(jī)物、磷、氮有良好的去除效果，去除效率分別可達(dá)55.95%、42.62%、77.78%。