基于AFM的人參水提物對(duì)VERO細(xì)胞氧化損傷作用研究

劉暢 曲英敏 李景梅

摘要[目的]研究人參水提物對(duì)VERO細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的氧化損傷。[方法]采用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)、MTT比色法、SOD和MDA試劑盒法、原子力顯微鏡（AFM）觀察法，研究人參水提物對(duì)VERO細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制。[結(jié)果]人參水提物對(duì)VERO細(xì)胞能夠起到明顯的增殖抑制作用。人參水提物對(duì)VERO細(xì)胞具有一定的的氧化損傷作用且有一定的劑量及時(shí)間依賴性。原子力顯微掃描成像結(jié)果表明正常生長的VERO細(xì)胞表面光滑、細(xì)胞體積飽滿，而人參水提物處理組細(xì)胞膜損壞現(xiàn)象明顯，細(xì)胞表面的粗糙度較大。[結(jié)論]人參水提物對(duì)VERO細(xì)胞具有一定的氧化損傷作用，其作用機(jī)制可能與細(xì)胞膜的損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞人參水提物；VERO細(xì)胞；原子力顯微成像；氧化損傷

中圖分類號(hào)TQ028.0文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）01-00113-04

基金項(xiàng)目吉林省科技廳項(xiàng)目（201215136）。

作者簡介劉暢（1987-），女，吉林長春人，碩士研究生，研究方向：生物材料，Email：165652403@qq.com。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事生物材料研究，Email：ljm3023@126.com。

收稿日期20131210人參是我國的一種傳統(tǒng)中藥[1]，但關(guān)于其毒性的報(bào)道較少。研究表明，人參水溶性蛋白對(duì)VERO細(xì)胞的體外增殖具有一定的抑制作用[2]。VERO細(xì)胞來源于非洲綠猴腎，具有無限增殖的特點(diǎn)，常用于藥物對(duì)腎臟毒性影響的試驗(yàn)[3]。唐蕊華等[4]通過原子力顯微鏡（AFM）對(duì)細(xì)胞表面掃描成像手段觀察Vero-E6細(xì)胞在被漢坦病毒感染前后細(xì)胞表面形貌的變化，結(jié)果表明使用AFM掃描經(jīng)不同稀釋度的漢坦病毒處理的細(xì)胞表面，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面粗糙程度、細(xì)胞表面的空洞數(shù)量均發(fā)生一定的改變，采用AFM技術(shù)可以通過觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)的變化粗略判斷出病毒感染細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程。筆者采用傳統(tǒng)的中藥煎煮法制備人參水提物，以非洲綠猴腎細(xì)胞作為人參水提物的受試細(xì)胞，探討人參水提物對(duì)腎細(xì)胞的毒性。

1材料與方法

1.1材料與儀器 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）、胰酶（Trypsin，長春天佳公司）；噻唑蘭（MTT，Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）、鮮人參（購于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，產(chǎn)地為吉林省撫松地區(qū)）、SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所）、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）、CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）、原子力顯微鏡（N9410S，Agilent）。

1.2提取物的制備取鮮人參根50 g，剪碎，加入700 ml蒸餾水，100 ℃條件下提取4 h，紗布過濾。濾渣重復(fù)提取2次，每次4 h。將3次所得濾液合并，60 ℃水浴濃縮至50 ml，離心（4 500 r/min，15 min），棄去沉淀。得到的上清即為人參水提物（WEG）。將WEG置于60 ℃水浴繼續(xù)濃縮，冷凍干燥后用少量無菌培養(yǎng)液將其溶解，原始濃度為200 mg/ml，用0.22 μm濾膜過濾除菌。用培養(yǎng)液稀釋成所需要的濃度。

1.3體外試驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代。將VERO細(xì)胞用含10%滅活胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液按照1×105個(gè)/ml的濃度接種于無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。0.25%胰酶消化液消化傳代，3～4 d傳代1次。試驗(yàn)所用VERO細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。

1.3.2MTT法檢測WEG對(duì)VERO細(xì)胞的影響。 將VERO細(xì)胞用含8%滅活胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640完全培養(yǎng)液按照1×105個(gè)/ml的濃度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2（95%空氣）培養(yǎng)箱內(nèi)。0.25%胰酶消化傳代，3～4 d傳代1次。試驗(yàn)所用VERO細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。

采用MTT比色法檢測人參水提物（WEG）對(duì)VERO細(xì)胞的增殖抑制作用。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至105個(gè)/ml，取若干塊無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使每孔加入100 μl含有上述懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液，靜置，移至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液。加入不同濃度的人參提取液，用培養(yǎng)液補(bǔ)足至200 μl，使每孔中藥物的終濃度為20、40、60、80、100 mg/ml，對(duì)照組加入空白培養(yǎng)液。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2（95%空氣）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，每12 h取出一塊培養(yǎng)板，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。在酶標(biāo)儀上以空白孔為對(duì)照調(diào)零，在波長490 nm處測定各孔的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算IC50值，以時(shí)間、濃度為橫軸，以光吸收值（A）、增殖抑制率為縱軸，繪制相應(yīng)曲線。

抑制率=（1-A490加提取液組細(xì)胞吸光值/A490對(duì)照組細(xì)胞吸光值）×100%

1.3.3WEG對(duì)VERO細(xì)胞氧化損傷的影響。按照SOD試劑盒、MDA試劑盒說明書中的方法，對(duì)不同濃度WEG處理24 h的VERO進(jìn)行SOD活性、MDA含量的檢測。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4VERO細(xì)胞的AFM探測。將經(jīng)75%乙醇溶液浸泡消毒的蓋玻片置于無菌6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種對(duì)數(shù)生長期的VERO細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度105～106個(gè)/ml，每孔2 ml。培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基并加入WEG，使每孔藥物的終濃度為20、40、60、80、100 mg/ml，對(duì)照組加入空白培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入無菌PBS輕輕沖洗每孔。棄掉PBS，每孔加入2.5%戊二醛固定細(xì)胞15 min。棄掉戊二醛，用超純水洗滌蓋玻片3次。將制備好的樣品置于原子力顯微鏡的XY掃描臺(tái)上，用監(jiān)視器定位所要掃描的樣品區(qū)域，輕敲模式成像。試驗(yàn)采用100 μm掃描器，標(biāo)準(zhǔn)硅探針，微懸臂的彈性系數(shù)為40 N/m，共振頻率為300 kHz，獲得圖像像素為512×512。AFM圖像以自帶軟件Pico Image Basic 6.2處理。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，P<0.05表示差異顯著。MTT中的抑制率曲線采用Origin 8.0軟件進(jìn)行分析處理。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度人參水提物對(duì)VERO細(xì)胞體外增殖的影響不同濃度的人參水提物（WEG）均對(duì)VERO細(xì)胞起到不同程度的增殖抑制作用。從圖1可以看出，隨著WEG濃度的增加，試驗(yàn)組VERO細(xì)胞存活數(shù)量明顯降低。

2.4WEG對(duì)VERO細(xì)胞氧化損傷的影響由表1可知，與對(duì)照組相比，各濃度WEG組的SOD活性呈明顯低于對(duì)照組，各組MDA含量明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。隨著WEG濃度的升高，各組SOD活性相應(yīng)降低，各組MDA含量對(duì)應(yīng)性升高。這說明人參水提物對(duì)VERO細(xì)胞的正常生長起到了破壞作用，使細(xì)胞受到損傷。

2.5原子力顯微鏡對(duì)VERO細(xì)胞的觀測結(jié)果基于原子力顯微鏡在納米尺度上的觀測技術(shù)對(duì)VERO細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的探測，希望能夠從WEG對(duì)VERO細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的影響來探討WEG對(duì)VERO細(xì)胞體外增殖的抑制作用。取經(jīng)20、40、60、80和100 mg/ml WEG培養(yǎng)2 d的VERO細(xì)胞，每組至少用AFM掃描成像10個(gè)細(xì)胞，獲得掃描范圍為80 μm×80 μm的VERO細(xì)胞及表面超微結(jié)構(gòu)圖（圖4）。

3討論

中草藥被認(rèn)為毒副作用小、使用安全，但仍有許多因用藥不當(dāng)而引發(fā)不良反應(yīng)的報(bào)道[5]。人參的主要活性成分是人參皂苷和人參多糖，其中關(guān)于人參皂苷的研究主要集中于改善機(jī)體免疫力、對(duì)心腦血管的保護(hù)作用、抗腫瘤作用等[6]，且研究大多局限于動(dòng)物試驗(yàn)，其應(yīng)用于臨床實(shí)踐的藥理作用仍需大量研究。據(jù)報(bào)道，當(dāng)將一定濃度的人參提取物添加到新生大鼠心肌培養(yǎng)基中時(shí)，新生大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)跳動(dòng)異常的現(xiàn)象，其濃度經(jīng)連續(xù)稀釋以后，心肌細(xì)胞跳動(dòng)異常情況隨之消失，但當(dāng)將相同濃度的人參提取物添加到成年大鼠的心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基中時(shí)，心肌細(xì)胞未見異常[7]。這說明人參提取物對(duì)新生大鼠的心肌細(xì)胞具有一定的毒性。

細(xì)胞的形貌、結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能有著重要的聯(lián)系，AFM對(duì)細(xì)胞表面形貌學(xué)研究與臨床研究的關(guān)系越來越密切，并具有著廣闊的應(yīng)用前景[8]。筆者通過AFM對(duì)WEG作用的VERO細(xì)胞前后形貌、超微結(jié)構(gòu)的對(duì)比，從納米尺度上直觀觀察WEG對(duì)VERO細(xì)胞形貌、結(jié)構(gòu)的變化，通過對(duì)結(jié)構(gòu)的觀察探索WEG對(duì)VERO細(xì)胞增殖抑制的機(jī)理。WEG能明顯抑制VERO細(xì)胞的體外增殖，并對(duì)VERO細(xì)胞具有一定的氧化損傷作用，通過原子力顯微鏡探測技術(shù)的引入，經(jīng)掃描成像發(fā)現(xiàn)WEG對(duì)VERO細(xì)胞的細(xì)胞膜具有一定的破壞作用。據(jù)此推斷，WEG對(duì)可能對(duì)人體的腎臟具有一定的損傷作用，隨著WEG濃度的降低，對(duì)腎臟的損傷作用有所減輕，其可能的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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