不同檢疫處理方法對常州地區(qū)擬出口花木介質(zhì)土中真菌的處理效果比較

王麗萍 陳文俊 鄭安明 李東明

摘要[目的]比較不同檢疫處理方法對常州地區(qū)擬出口花木介質(zhì)土中真菌的處理效果。[方法]以常州嘉澤鎮(zhèn)花木種植基地的介質(zhì)土為材料，對樣本中的真菌種群進(jìn)行分離、鑒定和分析，并研究熱處理、微波輻射、熏蒸處理3種不同檢疫處理方法對土壤微生物的抑制效果。[結(jié)果]從該地區(qū)的花木土壤中分離、純化和鑒定到包括青霉屬（Penicillium）等的17屬58種真菌；60、80、100 ℃的熱處理能較好地殺死或滅活介質(zhì)土中的微生物；微波處理和熏蒸處理對土壤微生物有明顯抑制效果。[結(jié)論]利用較高溫度處理土壤（100 ℃）、長時(shí)間的微波輻射和密閉熏蒸是較好的土壤處理方法。

關(guān)鍵詞介質(zhì)土；真菌；鑒定；檢疫處理

中圖分類號S184文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00080-03

作者簡介王麗萍（1986-），女，江蘇常州人，農(nóng)藝師，碩士，從事植物檢疫研究，Email：wlpsbc@126.com。

收稿日期20130903花卉苗木業(yè)是目前世界農(nóng)業(yè)最具活力的產(chǎn)業(yè)之一，全球年貿(mào)易額高達(dá)2 000億美元，并以每年10%的速度遞增。以嘉澤為代表的常州花卉苗木業(yè)2005年突破30億元，農(nóng)民人均收入達(dá)到8 000多元，目前產(chǎn)區(qū)總面積達(dá)21 333 hm2，年銷售額超60億元。隨著第八屆中國花博會在常州武進(jìn)的順利舉行，常州花木“向外走”的呼聲也越來越高。但除了在2007年向美國出口過一批12 000株的紅葉石楠外，幾乎沒有出口。花木出口最大的障礙在于國外檢疫機(jī)構(gòu)對我國出口的花木尤其是攜帶的介質(zhì)土設(shè)置了嚴(yán)格的檢疫要求。如何對介質(zhì)土進(jìn)行科學(xué)的檢疫處理，使其達(dá)到國外所規(guī)定的相關(guān)檢疫要求，破除花木出口的貿(mào)易壁壘，是急需解決的問題。為此，筆者對常州嘉澤鎮(zhèn)花木種植基地土壤中的真菌群落進(jìn)行了初步分離和鑒定，分析了花木基地的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，并研究了熱處理、微波輻射、熏蒸處理3種不同檢疫處理方法對土壤微生物的抑制效果，以期為花木出口企業(yè)進(jìn)行檢疫處理、土壤管理、栽培管理提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1供試土壤。試驗(yàn)土壤于2013年5月采自常州嘉澤花木基地。取5～15 cm層的土樣，置于冰盒，帶回常州出入境檢驗(yàn)檢疫局有害生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行真菌分離、高溫處理、微波輻射、熏蒸等處理。

1.1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)液。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 ml，高溫高壓滅菌。土壤浸漬培養(yǎng)基：1 000 g土壤浸于1 000 ml水，充分混勻后1∶5對水加入蔗糖10 g做成1 L營養(yǎng)液和瓊脂培養(yǎng)基。土壤搖菌培養(yǎng)液：1 000 g土壤浸于1 000 ml水，充分混勻后1∶5對水加入蔗糖10 g做成1 L營養(yǎng)液。

1.1.3試劑。DNA提取、ITS引物合成、PCR等分子生物學(xué)常用試劑購于上海生工生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1 土壤真菌的分離和鑒定。將同一地區(qū)采集的土樣混合均勻，過直徑為2 mm的篩，將較大土塊和植被的枝葉篩掉，共取10 kg，置于100 ml無菌水中30 ℃、200 r/min懸浮30 min，用稀釋平板分離法[1]進(jìn)行土壤真菌分離。將單胞稀釋分離出的菌落培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基48 h后，進(jìn)行形態(tài)學(xué)等的觀察和DNA提取，DNA提取參考劉少華等[2]的方法。PCR反應(yīng)體系（總體積為50 μl）：0.2 mmol/L dNTPs，0.5 mmol/L ITS1和ITS4引物，2.0 mmol/L Mg2+，1 U Taq酶，10倍緩沖液5 μl，DNA 10 ng左右。PCR循環(huán)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。DNA測序服務(wù)由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2.2 土壤熱處理。在常壓下，將已預(yù)處理的介質(zhì)土在60、80、100 ℃條件下分別處理2、4、8 h，以不處理作為空白對照。然后取處理好的土壤1 g，加入裝有培養(yǎng)液的三角瓶中，30 ℃振蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng)6、12、24 h后再取培養(yǎng)液放入分光光度計(jì)中測定OD600，以培養(yǎng)0 h的樣品為對照。

1.2.3 介質(zhì)土無害化微波處理。在常溫常壓狀態(tài)下，將已預(yù)處理的介質(zhì)土放在2 450 MHz頻率的微波條件下分別處理1、2、5 min，以不處理作為空白對照。然后取處理好的土壤1 g，加入裝有培養(yǎng)液的三角瓶中，30 ℃振蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng)6、12、24 h后再取培養(yǎng)液放入分光光度計(jì)中測定OD600，以培養(yǎng)0 h的樣品為對照。

1.2.4 介質(zhì)土無害化熏蒸劑處理。在常溫常壓狀態(tài)下，用含量不低于98%的溴甲烷氣體分別處理介質(zhì)土6、12、24 h，劑量為240 g/m3，以不處理作為空白對照。介質(zhì)土厚度不超過30 cm，處理后充分散氣。取處理好的土壤1 g，加入裝有培養(yǎng)液的三角瓶中，30 ℃振蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng)6、12、24 h后再取培養(yǎng)液放入分光光度計(jì)中測定OD600，以培養(yǎng)0 h的樣品為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 花木基地土壤真菌的種群組成通過對常州嘉澤花木基地土壤樣品中的真菌分離和純化，共鑒定出17個(gè)屬58個(gè)種真菌，分別是：青霉屬（Penicillium）15個(gè)種，木霉屬（Ttrichoderma）8個(gè)種，曲霉屬（Aspergillus）7個(gè)種，鐮孢屬（Fusarium）5個(gè)種，毛霉屬（Mucor）4個(gè)種，枝頂孢屬（Acremonium）3個(gè)種；枝孢菌屬（Cladosporium）、疫霉屬（Phytophthora）、毛殼菌屬（Chaetomium）、被孢霉屬（Mortierella）、粘帚霉屬（Gliocladium）各2個(gè)種，金孢屬（Chrysoporium）、腐質(zhì)霉（Humicola）、輪枝菌屬（Vertillium）、漆斑菌屬（Myrothecium） 、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）和絲核菌屬（Rhizoctonia）各1個(gè)種。其中，青霉屬、木霉屬、曲霉屬、鐮孢屬在該花木基地土壤中的種類、數(shù)量較多，分別占菌株總數(shù)的25.86%、13.79%、12.07%和8.62%，是該基地土壤的優(yōu)勢真菌菌群。

2.2土壤熱處理對土壤微生物的影響由圖1～圖3可知，60 ℃不同時(shí)間處理的土壤微生物在6～12 h生長不明顯，24 h后與0 h比較生長顯著，但明顯慢于未處理對照；80 ℃不同時(shí)間處理的土壤微生物在0～6 h生長不明顯，12 h后與0～6 h比較生長顯著，但明顯慢于未處理對照；100 ℃處理后的土壤微生物基本不生長，與0 h比較生長不顯著，未處理對照生長量顯著。

對土壤的消毒處理措施較多，該研究選取了簡單、快捷、易行的幾種措施，都取得較好的效果，其中利用較高溫度處理土壤（100 ℃）、長時(shí)間的微波輻射和密閉熏蒸是較好的土壤處理方法，對土壤微生物的抑制效果非常顯著。在高溫作用下，許多病原菌會被直接殺死，如白菜軟腐病菌在50.0 ℃下10 min即死亡、油菜菌核病的菌核在50.0 ℃下5 min即死亡、根結(jié)線蟲在47.5 ℃下15 min即死亡等。短時(shí)間或長時(shí)間的熱處理使土壤深層溫度達(dá)到一定高度，對殺死土壤中的病原菌作用較大。馮忠民等闡述了利用太陽能熱處理土壤來治理連作障礙的原理[4]。微波輻射也是直接殺死微生物的有效措施，不僅利用在土壤殺菌技術(shù)上，在土壤或生態(tài)環(huán)境的修復(fù)等方面也應(yīng)用廣泛。微波輻射殺死了土壤中的微生物，對土壤的有機(jī)質(zhì)含量、pH變化產(chǎn)生影響，從而影響土壤肥力[5]。土壤熏蒸是設(shè)施栽培很好的土壤消毒處理方法，能有效緩解土壤的鹽漬化、連作障礙等。根據(jù)《蒙特利爾議定書哥本哈根修正案》的相關(guān)規(guī)定，我國作為發(fā)展中國家，將在2015年禁用溴甲烷等對臭氧消耗嚴(yán)重的物質(zhì)[6]，新型高效土壤消毒劑有待研發(fā)。張騰等研究了1，3二氯丙烯、二甲基二硫、威百畝、甲酸甲酯4種熏蒸劑對土壤微生物的影響，其中甲酸甲酯和二甲基二硫在影響微生物數(shù)量及微生物生物量氮方面效果明顯[7]。

該試驗(yàn)的熱處理、微波處理和熏蒸處理結(jié)果有助于指導(dǎo)花木出口企業(yè)采取正確的檢疫處理措施，使土壤中病原菌數(shù)目下降到不至于引起作物病害造成檢疫風(fēng)險(xiǎn)或經(jīng)濟(jì)損失的程度。微波處理效果顯著，無公害，但前期投入較大，使用成本較高，相信隨著技術(shù)的改良和普及會成為一種重要的檢疫處理方法；熏蒸處理法作為一種傳統(tǒng)的檢疫處理方法，效果明顯，但隨著溴甲烷等熏蒸劑的禁用，目前已不適宜繼續(xù)推廣；熱處理簡單實(shí)用，無污染，適合在具備熱處倉的企業(yè)或口岸進(jìn)行推廣。

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[4] 馮忠民.陳云槐.徐欽輝，等.利用太陽能熱處理治理連作障礙[C]//植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全論文集.北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2008：152-154.

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[7] 張騰，燕平梅，李園，等.4種熏蒸劑對土壤微生物特性的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（3）：116-120.