深層發(fā)酵培養(yǎng)虎奶菇多糖的培養(yǎng)基優(yōu)化

王利 王峰

摘要[目的]優(yōu)化深層發(fā)酵培養(yǎng)虎奶菇多糖的培養(yǎng)基。[方法]以不同的培養(yǎng)基深層發(fā)酵培養(yǎng)虎奶菇菌絲體和多糖，分離胞內(nèi)和胞外多糖，在單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察碳源、氮源和金屬離子對(duì)虎奶菇生長(zhǎng)及虎奶菇多糖含量的影響。[結(jié)果]葡萄糖是最佳碳源，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和胞內(nèi)外多糖等代謝產(chǎn)物的積累，從而獲得高的多糖產(chǎn)率；酵母膏是最適氮源，可以獲得最高的菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量；金屬離子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響，在EDTA離子培養(yǎng)基里細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物累積效果最佳。在最優(yōu)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，總多糖含量為3.34 g/L，胞內(nèi)多糖含量為1.92 g/L，胞外多糖含量為80.34 mg/g，多糖產(chǎn)率為8.13%，細(xì)胞干重為23.62 g/L。[結(jié)論]該方法優(yōu)化了深層發(fā)酵培養(yǎng)虎奶菇多糖的培養(yǎng)基，為虎奶菇的種植栽培提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞虎奶菇（Pleurotus tuberregium）；深層發(fā)酵；多糖；培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)S646文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）01-00067-03

基金項(xiàng)目寧夏醫(yī)科大學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（XQ200913）；寧夏醫(yī)科大學(xué)教改課題（41）。

作者簡(jiǎn)介王利（1975- ），女，寧夏銀川人，碩士，從事教學(xué)和科研工作，Email：wllyhai@ sina.com。*并列第一作者，王峰（1972-），男，寧夏銀川人，副主任醫(yī)師，Email：761855602@qq.com。

收稿日期20131210虎奶菇（Pleurotus tuberregium），又名核耳菇、菌核側(cè)耳、茯苓側(cè)耳、虎奶菌、南洋獲苓，屬擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus），是一種子實(shí)體和菌核都可食用的珍稀食用兼藥用真菌[1]。鮮菇中含有多種生物活性酶，具有多種生理作用。其中，胰蛋白酶、麥芽糖酶等可以幫助消化；酪氨酸酶有降低血壓的作用；多糖化合物則有一定的防癌抗癌作用。菇中所含的脂肪多為不飽和脂肪酸，食用后不會(huì)增加血液中的膽固醇含量，可以預(yù)防動(dòng)脈硬化、心臟病及肥胖癥等。筆者對(duì)虎奶菇的深層發(fā)酵進(jìn)行分析，在菌絲體和發(fā)酵液中提取胞內(nèi)和胞外粗多糖，獲取虎奶菇深層發(fā)酵產(chǎn)生菌絲體和有效成分，在單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察碳源、氮源和金屬離子對(duì)虎奶菇生長(zhǎng)及虎奶菇多糖含量的影響，優(yōu)化深層發(fā)酵培養(yǎng)虎奶菇多糖的培養(yǎng)基，以期為虎奶菇的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象?；⒛坦剑≒leurotus tuberregium），來(lái)源于寧夏醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)實(shí)驗(yàn)中心。在MEDOUL培養(yǎng)基上活化菌株，4 d后于36 ℃溫育，-4 ℃保存。

1.1.2主要儀器。DIC發(fā)酵控制箱，購(gòu)自上海揚(yáng)諾鍋爐制造有限公司；HYGⅢ回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u瓶組件，購(gòu)自上海彥承實(shí)業(yè)有限公司；超凈工作臺(tái)，購(gòu)自濟(jì)南杰康凈化設(shè)備廠；HPS360 生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自斯特儀器設(shè)備有限公司；TDP3臺(tái)式離心機(jī)，購(gòu)自恒豐儀器制造有限公司；YXQLSSOSI 蒸煮器，購(gòu)自南寧藍(lán)天實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722分光光度計(jì)，購(gòu)自上海精科分析儀器廠；TGP8C離心機(jī)，購(gòu)自北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要試劑。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2方法

1.2.1菌種保藏。（1）基礎(chǔ)斜面培養(yǎng)基的制備。蛋白胨23 g/L；麥芽糖，6 g/L；CaCl2，0.06 g/L；葡萄糖，11 g/L；NaCl，0.026 g/L；MgSO4·7H2O，0.23 g/L；KH2PO4，0.4 g；（NH4）2HPO4，0.26 g；FeCl3（1%），1.3 ml；VB1，0.002 mg；瓊脂，21 g/L；pH5.4～5.8。（2）馬鈴薯培養(yǎng)基的制備。馬鈴薯（去皮）200 g，切成約2 cm2的小塊，在燒杯里蒸煮40 min，不斷攪拌，雙層紗布或者濾紙過(guò)濾留用濾液，添入23 g木糖，補(bǔ)足水至1 000 ml，pH自然，于120 ℃滅菌20 min。（3）搖瓶搖床成長(zhǎng)。先活化斜面菌種，劃線摘取些許菌絲體，在裝有100 ml液體培養(yǎng)基的250 ml搖瓶里接種，在30 ℃，220 r/min搖床上培養(yǎng)8 d。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的制備?；⒛坦骄z體及滋生胞內(nèi)多糖的影響因素有培養(yǎng)基組成、溫度和搖床轉(zhuǎn)速等[3]?；⒛坦蕉嗵橇渴懿煌荚础㈥?yáng)離子和氮源影響[3]，經(jīng)高等真菌培養(yǎng)，某些必需氨基酸，如蛋白胨、酵母膏、（NH4）2SO4，在發(fā)酵液中的細(xì)胞密度增高。氮源為有機(jī)氮源，因?yàn)榛⒛坦绞峭馍婢奶嫉?，僅僅可以吸收單糖和有機(jī)氮，碳源是葡萄糖、木糖和奶粉，氮源是蛋白胨、酵母膏和（NH4）2SO4，選擇合適C/N比，設(shè)計(jì)配方。調(diào)節(jié)pH不利于多糖形成，不同發(fā)酵時(shí)間至關(guān)重要。

1.2.3正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。為選擇最佳加工工藝條件，經(jīng)分析可知影響虎奶菇質(zhì)量的主要因素有碳源、氮源和離子等，試驗(yàn)取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1）。各試驗(yàn)組以綜合評(píng)分判定試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4虎奶菇菌絲體深層發(fā)酵培養(yǎng)。于28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)8 d后，從搖床拿出三角瓶，將發(fā)酵全液在3 000 r/min離心20 min，逐次收集上清液和菌絲體（菌絲體用蒸餾水沖洗并置于-18 ℃冰箱保存）。

1.2.5測(cè)定菌絲體生物量、胞內(nèi)多糖含量的測(cè)定與胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的計(jì)算。（1）各菌種生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。分別將各虎奶菇酵母菌以3%接種量接種到MRS、YEPD培養(yǎng)基中，每3 h取樣1次，測(cè)定OD600 nm值。（2）接種擴(kuò)培，離心收集菌體。根據(jù)文獻(xiàn)方法[1-3]，將各菌種在相應(yīng)的培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)期后期菌體，于6 000 r/min離心25 min，用生理鹽水洗滌2次，備用。（3）菌懸液制備。根據(jù)文獻(xiàn)方法[1-3]，虎奶菇酵母菌選擇不同的單一保護(hù)劑，分別配制成相應(yīng)濃度，滅菌（維生素C、L半胱氨酸過(guò)濾除菌，其余成分于120 ℃滅菌20 min），在收集的菌泥中加入上述各種單一保護(hù)劑[1-3]（菌泥、保護(hù)劑體積比為1∶3），再注入凍干管中，同時(shí)測(cè)定凍干前活菌數(shù)。

用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出Css（μg/ml），采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，發(fā)酵液多糖含量=Css×稀釋因子/1 000（mg/ml）。計(jì)算表達(dá)式如下：菌絲體多糖產(chǎn)量（mg/ml）=胞內(nèi)多糖含量×生物量/培養(yǎng)液量；菌絲體多糖含量=Csm×稀釋因子×（提取液體積/菌絲質(zhì)量）/1 000。采用SAS 擬合葡萄糖含量與吸光度的線性回歸，由LSD法計(jì)算出DM、EPS、RS和TPS。

2結(jié)果與分析

2.1不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)虎奶菇菌絲的生物量的影響由表2和表3可知，不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)虎奶菇菌絲的生物量均有明顯影響。以葡萄糖、奶粉和木糖為碳源培養(yǎng)的菌絲體多糖產(chǎn)率之間有顯著差異（P≤0.05）；綜合結(jié)果可知，最佳碳源為葡萄糖。以酵母膏、（NH4）2SO4和蛋白胨三者為氮源培養(yǎng)的菌絲體的多糖產(chǎn)率之間有顯著差異；綜合結(jié)果可知，最佳氮源為酵母膏。金屬離子對(duì)菌絲生物量也有顯著影響，EDTA、氯化鐵之間無(wú)差異性，但與氯化鈣均有顯著差異。

2.2不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)胞外多糖的影響由表2和表4可知，不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)胞外多糖均有明顯影響。以葡萄糖、奶粉和木糖為碳源培養(yǎng)的菌絲體胞外多糖含量均有極顯著差異（P≤0.01）；綜合結(jié)果可知，以葡萄糖為碳源培養(yǎng)的胞外多糖產(chǎn)率最高。氮源酵母膏、（NH4）2SO4培養(yǎng)的胞外多糖含量與蛋白胨之間有顯著差異；綜合結(jié)果可知，酵母膏是最佳氮源。金屬離子EDTA培養(yǎng)的胞外多糖含量與鐵離子、鈣離子之間也有差異性。

2.3不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)胞內(nèi)多糖的影響由表2和表4可知，不同發(fā)酵培養(yǎng)基的胞內(nèi)多糖含量有明顯影響。葡萄糖與奶粉、木糖二者之間的胞內(nèi)多糖有極顯著差異（P<0.01），葡萄糖做碳源的胞內(nèi)多糖值較高；氮源（NH4）2SO4、蛋白胨二者與酵母膏的胞外多糖有顯著差異（P<0.05），（NH4）2SO4是優(yōu)化氮源，能產(chǎn)生較高胞內(nèi)多糖的菌絲體；金屬離子則對(duì)胞內(nèi)多糖積累，無(wú)顯著性影響（P>0.05）。

2.4不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)總多糖的影響由表2和表6可知，不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)總多糖含量有明顯影響。葡萄糖、奶

2.5pH的考察由表2和表7可知，發(fā)酵過(guò)程中pH值有所下降。不同組成發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)最終pH值均有明顯影響。以葡萄糖、奶粉、木糖為碳源的培養(yǎng)基最終pH值無(wú)顯著差異（P>0.05）。酵母膏、（NH4）2SO4與蛋白胨之間的最終pH值表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）；EDTA、金屬離子鐵、鈣之間的最終pH值差異不顯著（P>0.05）。

2.6發(fā)酵殘?zhí)锹剩≧S）分析值的估量比較由表2和表8可知，發(fā)酵培養(yǎng)基組分對(duì)虎奶菇的發(fā)酵殘?zhí)锹剩≧S）有明顯影響。以葡萄糖、奶粉和木糖為碳源的培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵殘?zhí)锹视袠O顯著影響（P<0.01）；以葡萄糖的生物利用率高，但相對(duì)奶粉、木糖有較低的殘留。酵母膏、（NH4）2SO4、蛋白胨培養(yǎng)的發(fā)酵殘?zhí)锹手g無(wú)顯著差異（P>0.05）。EDTA、鐵、鈣離子之間的發(fā)酵殘?zhí)锹薀o(wú)顯著差異（P>0.05）。

2.7多糖產(chǎn)率（TPS）均值估計(jì)比較由表2和表9可知，不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)虎奶菇多糖產(chǎn)率有明顯影響。以葡萄糖為碳源培養(yǎng)的生物代謝產(chǎn)物累積率最高；以酵母膏為氮源培養(yǎng)的多糖產(chǎn)率與蛋白胨、（NH4）2SO4有顯著差異（P<0.05）；EDTA、鐵和鈣離子對(duì)多糖產(chǎn)率無(wú)顯著影響（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

虎奶菇主要的成分為多糖體，如虎奶菇中的虎奶多糖（lentinan），這些具高分子量的多糖有強(qiáng)的抗癌作用[4-5]。其中，有關(guān)虎奶菇多糖抗腫瘤的研究較多。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高分子多糖體主要是依據(jù)增強(qiáng)體內(nèi)細(xì)胞的防衛(wèi)能力而達(dá)到防癌的功能。在最優(yōu)化培養(yǎng)基的條件下發(fā)酵，總多糖含量達(dá)3.34 g/L，胞內(nèi)多糖含量達(dá)1.92 g/L，胞外多糖含量達(dá)80.34 mg/g，多糖產(chǎn)率為8.13%，細(xì)胞干重為23.62 g/L。