透明質(zhì)酸搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

黃小忠 曹志杰 張雪松 凡軍民

摘要[目的]優(yōu)化透明質(zhì)酸搖瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基。[方法]利用Plaekett-Burman設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法（RSM）對透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，確定影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量的關(guān)鍵因子。[結(jié)果]影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量的關(guān)鍵因子為葡萄糖和酵母膏，葡萄糖最佳濃度為55.78 g/L，酵母膏的最佳濃度為23.43 g/L；在此條件下，發(fā)酵液透明質(zhì)酸的平均產(chǎn)量為0.219（OD400nm）。[結(jié)論]通過對培養(yǎng)基的優(yōu)化，透明質(zhì)酸產(chǎn)量得到提高，試驗(yàn)值與預(yù)測值基本一致。

關(guān)鍵詞獸疫鏈球菌；優(yōu)化；透明質(zhì)酸；響應(yīng)面分析

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00015-02

作者簡介黃小忠（1981-），男，江蘇海安人，講師，碩士，從事生物工程研究，Email：523855294@qq.com。

收稿日期20131209透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，簡稱HA），又名玻尿酸，是一種白色無味的纖維狀或者無定形物質(zhì)，易溶于水。HA的水溶液呈酸性，帶一定的負(fù)電荷。其分子是由β-D-葡萄糖醛酸和β-D-N-乙酰氨基葡萄糖的雙糖單位反復(fù)交替連接而成的高分子物質(zhì)，廣泛存在于動物組織間質(zhì)中，也是鏈球菌、綠膿桿菌等菌株莢膜的主要成分[1]。筆者以獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）作為透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌，利用Plaekett-Burman設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法（RSM）對透明質(zhì)酸搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，詳細(xì)考察了培養(yǎng)基中葡萄糖和酵母膏濃度對透明質(zhì)酸產(chǎn)量的影響，確定其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳濃度，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus），由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要儀器。超凈工作臺，離心機(jī)，搖床，分光光度計(jì)，培養(yǎng)箱。

1.1.3 主要試劑。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB試液）為分析純，市售；無菌水及去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備。①斜面培養(yǎng)基。葡萄糖5.0 g/L， 蛋白胨10.5 g/L，牛肉膏5.5 g/L，酵母膏7.14 g/L，酵母粉2.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，瓊脂2%，pH值7.0，121 ℃滅菌25 min[2]。②種子培養(yǎng)基。以斜面培養(yǎng)基為基礎(chǔ)不添加瓊脂。③發(fā)酵培養(yǎng)基。蛋白胨10.5 g/L，牛肉膏5.5 g/L，酵母粉2.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，pH值7.0，121 ℃滅菌25 min。葡萄糖及酵母膏取優(yōu)化后濃度。

1.2.2 培養(yǎng)方法。①菌種活化。取斜面保藏的原始菌種，接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h。②種子培養(yǎng)。取5 ml無菌水沖洗斜面，經(jīng)離心機(jī)4 500 r/min離心10 min，去上清液；用無菌水洗滌沉淀2次，重新懸浮于5 ml無菌水中，搖勻后倒入盛有45 ml無菌水的100 ml三角瓶中，振蕩10 min；分別取45 ml液體培養(yǎng)基于250 ml三角搖瓶，加上述菌懸液5 ml，起始pH值7.0，轉(zhuǎn)速250 r/min ，37 ℃下培養(yǎng)18 h。③發(fā)酵培養(yǎng)。取種子液，接種量10%，搖瓶裝液量20%，轉(zhuǎn)速250 r/min，37 ℃下培養(yǎng)24 h[3]。

1.2.3 測定方法。取樣，每瓶抽取不少于6 ml的發(fā)酵液，于5 000 r/min離心5 min，去除培養(yǎng)液中的菌體，小心準(zhǔn)確量取5 ml清液，再加入適量的無水乙醇，在4 ℃下沉淀1 h，再次以5 000 r/min離心5 min，去上清液，取沉淀，準(zhǔn)確加入10 ml去離子水溶解沉淀，加入CTAB試液，以接種的培養(yǎng)液經(jīng)相同處理后為空白對照，使用分光光度計(jì)在400 nm波長下測定吸光度，通過OD值來比較HA的含量[4]。

1.2.4 菌體量測定。利用分光光度計(jì)，在波長660 nm處測定一定稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液的吸光度，通過OD值來評價(jià)菌體含量的高低。

1.2.5 Plackett-Burman試驗(yàn)確定關(guān)鍵因素。通過單因子試驗(yàn)，確定各因素的參照范圍，制定基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配方[5]，試驗(yàn)因素水平編碼見表1，利用6因子2水平Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)選出搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的關(guān)鍵因子。

1.2.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以最大產(chǎn)量區(qū)進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，因素水平編碼見表2。

2結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman試驗(yàn)確定關(guān)鍵因素 由表3可知，經(jīng)過Plackett-Burman試驗(yàn)的顯著性分析，葡萄糖、酵母膏為顯著影響因子（可信度大于90%，主效應(yīng)p≤0.1）。因此選取葡萄糖和酵母膏為主要影響因素。

2.2最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果中葡萄糖、酵母膏2個(gè)主要影響因素濃度的大小，確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和變化步長，同時(shí)通過最快的速度靠近最大HA產(chǎn)量的區(qū)域。其他因子濃度分別為：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L。由表4可知，主要因素濃度處在第8組試驗(yàn)的條件下，HA產(chǎn)量最高。故以試驗(yàn)8的條件作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平的中心點(diǎn)。即葡萄糖、酵母膏的濃度分別為55和22 g/L。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化HA的發(fā)酵培養(yǎng)基 響應(yīng)曲面法（RSM）廣泛應(yīng)用可以使得產(chǎn)品的開發(fā)成本得到大幅的降低，產(chǎn)品生產(chǎn)的工藝得到優(yōu)化，產(chǎn)品的質(zhì)量得到提高，尤其對于微生物發(fā)酵條件的優(yōu)化具有其獨(dú)特有的優(yōu)勢，除了可以考察各個(gè)顯著影響因素之間交互作用對優(yōu)化結(jié)果的影響，還能考慮發(fā)酵條件中的各種重要影響因素[6]。

2.3.1 二次回歸模型擬合及方差分析。用SPSS軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析和方差分析，進(jìn)行回歸擬合可以得到產(chǎn)量Y對編碼自變量X1、X2的回歸方程：

2.3.2 響應(yīng)面分析。利用Design-Expert軟件，結(jié)合回歸方程繪制出響應(yīng)面分析圖及等高線圖（見圖1）。響應(yīng)面圖代表2個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，由響應(yīng)面和相應(yīng)的等高線可以看出，兩因素之間的相互作用都比較明顯[7]。

為了進(jìn)一步確定HA最大產(chǎn)量的穩(wěn)定點(diǎn)，對回歸方程進(jìn)行整理，解方程得模型的極值點(diǎn)為X1=55.78 g/L，X2=23.43 g/L，代入回歸方程，解得預(yù)測HA產(chǎn)量為0.221（OD400nm）。經(jīng)過進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)，通過3次平行試驗(yàn)，得到發(fā)酵液HA平均產(chǎn)量為0.219（OD400nm），與模型的預(yù)測值接近，說明該模型能較好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵情況。

3結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)以及Box-Behnken設(shè)計(jì)三者相結(jié)合是比較適合于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合，能快速方便的優(yōu)化培養(yǎng)基成分以及確定發(fā)酵工藝的關(guān)鍵因素。Design-Expert是一種能方便的進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化分析的軟件，使用該軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到的結(jié)果比較可靠，能滿足相關(guān)試驗(yàn)對數(shù)據(jù)處理的要求。