原位內(nèi)生根方法測(cè)定枇杷樹細(xì)根呼吸的研究原位內(nèi)生根方法測(cè)定枇杷樹細(xì)根呼吸的研究

劉功輝 李坤 彭歡等

摘要[目的]探索一種原位沙培內(nèi)生根的根呼吸測(cè)定方法，并同離體測(cè)定方法相結(jié)合觀測(cè)成熟枇杷[Eriobotrya Japonica （Thunb.） Lindl.]果樹的細(xì)根呼吸。[方法]將枇杷細(xì)根放入裝有洗脫了有機(jī)質(zhì)河沙的根室內(nèi)培養(yǎng)11 d后，分別在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)每隔2 h用Li8100 CO2測(cè)定系統(tǒng)（Licor，USA）測(cè)定內(nèi)生根的CO2排放量。[結(jié)果]所有內(nèi)生根樣品直徑范圍在0.69～2.15 mm，非內(nèi)生根樣品直徑范圍在0.66～1.70㎜；根呼吸速率在近地表溫度20.5～30.5 ℃和0～5㎝土層溫度15.9～23.3 ℃范圍內(nèi)測(cè)定的平均值為7.52±4.96 nmol/（DM2·s），非內(nèi)生根離體測(cè)定值1.76±0.20 nmol/（DM2·s），內(nèi)生根法原位測(cè)定值是非內(nèi)生根離體測(cè)定值的3倍。[結(jié)論]內(nèi)生根方法通過改進(jìn)可以用于成熟林木細(xì)根呼吸乃至其他代謝活性研究。

關(guān)鍵詞內(nèi)生根法；離體根法；沙培；細(xì)根呼吸；枇杷

中圖分類號(hào)S667.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）01-00012-03

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070548，31170578）。

作者簡(jiǎn)介劉功輝（1988- ），男，江西于都人，碩士研究生，研究方向：森林生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)。*通訊作者，教授，從事森林碳氮循環(huán)方面研究，Email：r.gao@hotmail.com。

收稿日期20131210人類活動(dòng)使得全球大氣變化加劇，特別是溫室氣體的大量排放，使得森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。土壤呼吸是全球碳循環(huán)的主要途徑之一。Hanson等[1]研究表明，根系呼吸占土壤總呼吸的10%～90%，其中森林植物的根系呼吸占45.8%，非森林植物的根系呼吸占604%。根系的呼吸作用是生態(tài)系統(tǒng)碳素循環(huán)中重要的反饋途徑之一[2-3]，在調(diào)節(jié)碳循環(huán)過程中發(fā)揮著十分重要的作用[4-6]。嚴(yán)格的根呼吸屬于自養(yǎng)呼吸，包括活根組織呼吸、共生菌根真菌呼吸、分解剛剛死亡的根組織和根分泌物的微生物呼吸[7]。但是，在實(shí)際研究過程中，很難將根呼吸和根際微生物呼吸以及根呼吸產(chǎn)生的CO2和土壤碳礦化產(chǎn)生的CO2區(qū)分開來(lái)。這已經(jīng)成為定量研究根圈碳通量的最大挑戰(zhàn)之一[8] 。目前，根呼吸的測(cè)定主要有直接測(cè)定和間接測(cè)定2種方法。間接測(cè)定法包括根系去除法、壕溝隔斷法和林間空隙法[9]。直接測(cè)定法包括離體根、PVC管氣室法、同位素法等[10]。其中，離體根法和管氣室法是2種常用的基本方法。由于植物根呼吸很難從土壤呼吸中分離出來(lái)，其野外原位測(cè)定一直未能得到很好地解決。該研究以枇杷（Eriobotrya Japonica （Thunb.）Lindl.）樹為對(duì)象，探索一種根呼吸原位測(cè)定方法-原位內(nèi)生根法，為研究成熟林木根呼吸及其他生態(tài)生理活性提供科學(xué)方法。

1材料與方法

1.1研究地概況研究地位于福州市閩侯縣福建師范大學(xué)旗山校區(qū)實(shí)驗(yàn)地的枇杷園（26°5′N，119°10′E）。枇杷果園約建立于2000年，面積0.2 hm2，栽植密度2 m×2 m，間作有龍眼樹（Democarpus longdan Lour.），枇杷樹齡7年，平均高4.4 m，平均基徑19.1 cm，平均冠幅2.79 m。該區(qū)域氣候類型為中亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，氣候暖熱、濕潤(rùn)，夏長(zhǎng)冬短，光熱資源豐富，霜凍少，無(wú)霜期長(zhǎng)，240～320 d，作物生長(zhǎng)期長(zhǎng)。平均氣溫在9～11 ℃，最冷月氣溫在10 ℃左右，最熱月氣溫在28 ℃左右。年平均降水量1 673.9 mm，年總輻射為448.94 kJ/cm2。供試土壤為紅壤，有機(jī)質(zhì)含量平均為39.00 g/kg，全氮含量平均為1.46 g/kg。

1.2試驗(yàn)材料

1.2.1基質(zhì)。培養(yǎng)基質(zhì)為普通河沙。過0.5 mm篩，用清水反復(fù)清洗，直到水呈無(wú)色透明，以去除黏土和有機(jī)質(zhì)；用濃度3%的鹽酸溶液浸泡3～4 d，去除砂粒表面的碳酸鈣和其他鹽類，然后用清水清洗，直到水中沒有氯離子為止；用蒸餾水漂洗幾次，烘干后裝入干凈的帶蓋容器中待用。

1.2.2根室。根室為PVC材料，內(nèi)徑100 mm，外徑99 mm，高120 mm，底蓋鉆5個(gè)直徑1 mm小孔用于排水，側(cè)面鉆若干直徑3 mm小孔，數(shù)量、位置安裝視根系情況而定。根室同時(shí)用作Li8100腔室的底座。離體根測(cè)定用的腔室也用相同材質(zhì)和直徑的PVC材料制成，高度30 mm。

1.2.3營(yíng)養(yǎng)液。采用荷格倫特（Hoagland）完全營(yíng)養(yǎng)液（配方為1.大量元素，每升培養(yǎng)液中加入1 mol/L KH2PO4 1 ml，1 mol/L KNO3 5 ml，1 mol/L Ca（NO3）2 5 ml，1 mol/L MgSO4 2 ml；2.微量元素，每升培養(yǎng)液中加入H3BO3 2.86 g，MnCl2·4H2O 1.81 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.08 g，H2MoO4·H2O 0.02 g）。營(yíng)養(yǎng)液先配制貯備液，使用時(shí)將其稀釋為所需濃度，配置貯備液時(shí)將所需各種試劑分別溶解，并分別用棕色試劑瓶盛裝，置于避光陰涼處保存。在配制稀釋液時(shí)，用0.1 mol/L NaOH和HCl調(diào)pH至5.6。

1.3野外安裝與觀測(cè)共有6個(gè)根室和6個(gè)相應(yīng)的對(duì)照（編號(hào)A、B、C、D、E、F，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)發(fā)現(xiàn)B組損壞）。在安裝根室時(shí)，在每個(gè)所選安裝根室的適當(dāng)位置挖直徑20 cm、深10 cm的洞，并將其中的根小心剝離出來(lái)，根據(jù)根的實(shí)際位置在根室的相應(yīng)部位用便攜式手鉆鉆3 mm直徑的孔，將剝離出來(lái)的根用蒸餾水清洗，清洗后用濾紙吸干。將處理好的根穿入事先做好的根室內(nèi)，并用704膠大致封住插入根的小孔。分3次填入沙子，每次填入沙子后定量加入蒸餾水和營(yíng)養(yǎng)液，最后填入沙子于地面平齊，并且保證根室露出地表2 cm，根室內(nèi)水分相當(dāng)于沙子的最大持水量。把挖出的土部分回填于根室四周的縫隙中并壓實(shí)。各根室的對(duì)照除無(wú)根外其他處理相同。各根室、對(duì)照在不測(cè)定CO2通量時(shí)用一種透氣、不透水的薄膜蓋住，防止干濕沉降、凋落葉和其他雜物進(jìn)入以及下雨時(shí)濺入泥土。試驗(yàn)共培養(yǎng)觀測(cè)11 d，營(yíng)養(yǎng)液分2次加入根室中，其中第1次（5月3日，安裝根室時(shí)）加入所需營(yíng)養(yǎng)液總量的60%，第2次（5月6日）加入所需營(yíng)養(yǎng)液總量的40%。每月施肥量為4 g N/m2 。

根室、對(duì)照于2007年5月3日安裝，于5月4、6、8、10日每隔2 h（即7：00、9：00、11：00、13：00、15：00、17：00）用Li8100 CO2測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定CO2通量（nmol/（DM2·s）），同時(shí)用溫度計(jì)（Sato，SK250WP）和土壤水分測(cè)定儀（TDR，TDR300）測(cè)定各根室和對(duì)照周圍的土壤溫度和體積含水量（10 cm深）。在5月13日，還進(jìn)行非內(nèi)生根呼吸離體測(cè)定以及內(nèi)生根呼吸離體測(cè)定。前者每測(cè)完一組根樣品后隔5 min（實(shí)際是3～9 min）再測(cè)定1次。

當(dāng)非內(nèi)生根離體測(cè)定時(shí)，將根小心挖出后，用蒸餾水小心潤(rùn)洗干凈，再用濾紙吸干和原位保存。測(cè)量時(shí)剪下并立即（<1 min）放入離體根測(cè)定用的腔室內(nèi)，用Li8100進(jìn)行呼吸測(cè)定，測(cè)量后用潤(rùn)濕的濾紙包裹，放入自封袋保存，帶回實(shí)驗(yàn)室用電子天平稱量（0.000 1 g），用掃描儀（Expression 1680，ETSON）掃描。掃描圖像在計(jì)算機(jī)上用根系圖象分析系統(tǒng)（WINRHIZO）測(cè)定直徑、根長(zhǎng)、表面積、體積等形態(tài)指標(biāo)。掃描后，根系在65 ℃下烘24 h，稱烘干后質(zhì)量（0.000 1 g），計(jì)算根含水率。烘干根樣品用微型粉碎機(jī)粉碎，用C/N 元素分析儀（Elementar Vario EL III）測(cè)定C、N含量。

5月13日，在進(jìn)行每個(gè)內(nèi)生根室根呼吸原位后就進(jìn)行內(nèi)生根離體測(cè)定。內(nèi)生根離體測(cè)定和處理方法同前非內(nèi)生根離體方法。采用各處理的面積基呼吸通量（nmol/（DM2·s））減去對(duì)照組的面積基呼吸通量（nmol/（DM2·s）），再由根系干物質(zhì)量換算成干物質(zhì)基的呼吸通量（nmol/（DM2·s））。

1.4數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析用軟件為SPSS11.5，方差分析用ANOVALSD方法。顯著性水平P=0.01。

2結(jié)果與分析

2.1原位內(nèi)生根呼吸由表1可知，所采集枇杷內(nèi)生根樣品直徑范圍為0.69～2.15 mm，平均為1.25 mm；根系的含水率為0.40～0.64 g/g，變化較大。由表2可知，在觀測(cè)期內(nèi)，近地表溫度變化20.5～30.5 ℃，近地表空氣濕度57.1%～70.2%，0～5 cm土壤溫度15.9～23.3 ℃，近地表CO2濃度407.2～420.5 mg/kg。由表3可知，在以上測(cè)定環(huán)境中，原位測(cè)定內(nèi)生根呼吸速率平均值為7.52 ± 4.96 nmol/（DM2·s），變化范圍為3.20～14.09 nmol/（DM2·s）。

2.2離體非內(nèi)生根呼吸由表4可知，枇杷非內(nèi)生根樣品直徑范圍0.66～1.70 mm，平均1.14 mm；非內(nèi)生根呼吸離體測(cè)定值1.76 ± 0.20 nmol/（DM2·s），變化范圍1.47～2.06 nmol/（DM2·s）。由表5可知，根離體后3～9 min測(cè)定值比1 min內(nèi)測(cè)定值偏低，但差異不顯著。

表3原位測(cè)定內(nèi)生根呼吸速率位置05040506050805100513A1.8512.336.246.4812.72C4.484.851.842.7616.21D3.222.542.003.2410.17E2.147.409.4915.2318.09F4.308.977.5910.5713.28平均值3.207.225.437.6614.09標(biāo)準(zhǔn)差1.203.763.415.263.10表4枇杷樹非內(nèi)生根樣品生物學(xué)參數(shù)

2.3原位內(nèi)生根與離體根測(cè)定的比較方差分析表明，內(nèi)生根法原位測(cè)定值比非內(nèi)生根離體測(cè)定值大3倍。國(guó)外也有類似的報(bào)道[11-12]。但是，由于目前根呼吸真值測(cè)定方法還在探索中，還很難解釋這一現(xiàn)象。內(nèi)生根離體測(cè)定值比內(nèi)生根法原位測(cè)定值低，部分說明根的活性在根室培養(yǎng)過程中受一定的影響。與非內(nèi)生根相比，內(nèi)生根的含水率變化較大，說明沙培法對(duì)根的活性也有所影響。

2.4內(nèi)生根原位根呼吸的環(huán)境影響在內(nèi)生根呼吸原位測(cè)量期間，不同處理近地表溫度、地面溫度、濕度等參數(shù)間變化（包括日變化和日間變化）不明顯，導(dǎo)致內(nèi)生根呼吸同溫度、濕度的相關(guān)關(guān)系也不明顯。這說明內(nèi)生根各處理的測(cè)定環(huán)境比較一致，有利于試驗(yàn)內(nèi)生根方法的評(píng)價(jià)。另外，根室內(nèi)外的溫度測(cè)定結(jié)果表明兩者差別不顯著，說明原位測(cè)定溫度條件同周圍土壤環(huán)境的一致性。

2.5原位內(nèi)生根方法評(píng)價(jià)由圖1可知，內(nèi)生根法測(cè)定的根呼吸在不同時(shí)間不同處理間出現(xiàn)波動(dòng)，除了與選擇根樣品本身性質(zhì)不同有關(guān)外，還與測(cè)定環(huán)境條件差異（但這種差異不顯著）及測(cè)定方法本身限制有關(guān)。測(cè)定方法本身限制可能有以下方面。

（2）對(duì)照的有效性。試驗(yàn)設(shè)立的對(duì)照處理最大限度地避免因根室底部排水孔和根室微生物污染所造成的測(cè)定誤差。但是，由于對(duì)照和根室存在一定的距離，對(duì)照的效果有一定的局限性。

（3）根圍的密封性。試驗(yàn)根穿過根室后的側(cè)孔空隙用704膠封閉時(shí)可能未黏閉好，導(dǎo)致根室內(nèi)CO2泄露或外界環(huán)境中CO2進(jìn)入根室內(nèi)，而對(duì)照沒有側(cè)孔，因而對(duì)照對(duì)此誤差難以校正，需要今后在操作時(shí)改進(jìn)。

（4）根系的擾動(dòng)性。由于內(nèi)生根處理時(shí)需要把土壤中根剝離出來(lái)，洗凈后插入根室中培養(yǎng)。這種轉(zhuǎn)移可能對(duì)根造成一定的傷害，對(duì)根的呼吸造成一定的影響。另外，用營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行根培養(yǎng)，最大限度地模擬根的生長(zhǎng)環(huán)境，但培養(yǎng)基質(zhì)與原位土壤有一定的差異，今后可考慮使用原位滅菌土壤作為培養(yǎng)基質(zhì)。

3結(jié)論

原位內(nèi)生根方法的限制因素是可以通過選擇材料和細(xì)心操作加以克服的。總之，內(nèi)生根方法通過改進(jìn)可以用于成熟林木細(xì)根呼吸及其代謝活性研究。

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