檀香炭疽病病原鑒定及其生物學特性研究

劉倩麗等

摘 要 針對海南省近幾年來趨重發(fā)生的檀香炭疽病，通過對該病病原進行形態(tài)學觀察，致病性測定及rDNA-ITS序列分析，并研究病原菌生物學特性。結果表明，檀香炭疽病病原為Colletotrichum fructicola，該菌菌絲及分生孢子均能在10～35 ℃條件下生長，且菌絲最適生長溫度及分生孢子最適萌發(fā)溫度為30 ℃。該菌菌絲生長能適應的pH值范圍為4.0～11.0，最適pH值為6.0，分生孢子萌發(fā)pH范圍為4.0～11.0，最適萌發(fā)pH為5.0，光照條件下最有利于菌絲的生長，而黑暗條件下有利于分生孢子的萌發(fā)。該病病原菌在以蔗糖、可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長較好，在以蛋白胨、尿素、酵母膏浸粉、硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長較好。

關鍵詞 檀香；炭疽??；形態(tài)學；rDNA-ITS序列；生物學特性

中圖分類號 S763.15 文獻標識碼 A

Abstract Santalum album L. anthracnose occurs much more seriously in some areas of Hainan. The aim of the research was to figure out the species of anthracnose on S. album L.， The pathogen was identified with its morphologic characters， pathogenicity and rDNA-ITS sequence analysis， and the biological characteristics of the pathogen was also studied. The results showed that C. fructicola was the pathogens of S. album L. anthracnose. The mycelium of pathogen could grow normally at 10～35 ℃， but the favorable temperature was 30 ℃. The conidia germinated at 10～35 ℃， but the optimum temperature was 30 ℃. Mycelia could grow normally on PDA of which pH was among 4.0～11.0， but the optimum pH was 6.0. The conidia could germinate at pH4.0～11.0， but the favorable pH was 5.0. Lightness was favorable for mycelial growth， and darkness was optimum for conidial germination. Sucrose carbon and soluble starch was suitable for mycelial growth， Among the tested media of the nitrogen sources， Czapka liquid medium containing peptone， urea nitrate， yeast extract powder or ammonium sulfate was favorable for mycelia growth.

Key words Santalum album L.； Anthracnose； Morphology； rDNA-ITS sequence； Biological characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.028

珍貴樹種資源是全球重要的戰(zhàn)略資源，其培育工作涉及到林業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略乃至國家的長遠利益[1]。檀香（Santalum album Linn.）是檀香科（Santalaceae）檀香屬的一種半寄生小喬木，現(xiàn)被列為國家重點保護植物。檀香應用最廣泛的為化妝品、梳妝用品、醫(yī)藥用品、芳香療法用品。檀香還是良好的冷凍劑、收斂劑、退熱劑，能用于治療偏頭痛、丹毒、淋病、膀胱炎等。檀香心材中提取的檀香油是配制高級香水、香精不可缺少的原料之一[2]。檀香屬共有16個樹種、15個變種，都為常綠半寄生的小喬木或灌木，心材都含有芳香性的檀香油。近幾年來被廣泛地商業(yè)性的引種栽培[2]，因此對檀香病害的研究與防治就顯得至關重要。

檀香的主要病害有炭疽病、煤污病、苗木立枯病、根腐病、白粉病等。但在整個海南省病蟲害調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)檀香炭疽病是危害檀香幼樹生長的主要病害。感病初期葉片邊緣或中心出現(xiàn)淺褐色的病斑，周圍有淺紫色暈圈，隨著病斑不斷擴大，病斑處呈深灰褐色，且長滿黑色的小點，病健交界處呈紫褐色。最后病斑處穿孔，造成植株提前落葉。關于檀香炭疽病，目前尚未有比較系統(tǒng)的研究，更無有效的林間防治措施。筆者從檀香炭疽病病原入手，在形態(tài)學鑒定和分子鑒定的基礎上，深入研究了該病病原菌的生物學特性。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：2013年5月從海南澄邁縣國營澄邁林場采集到的檀香炭疽病樣本進行常規(guī)組織分離和單胞純化后[3]，得到供試菌株，移入斜面培養(yǎng)基中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 病原菌形態(tài)觀察 將采集到的檀香病葉放入人工氣候培養(yǎng)箱中，覆上保鮮膜，保濕培養(yǎng)幾天后，用單面刀片將病斑處切成極薄的小片，從而制做成徒手切片，在顯微鏡下觀察病原菌的菌絲形態(tài)。將供試菌株在新鮮PDA培養(yǎng)基上活化6 d后，用接種針挑取培養(yǎng)基表面菌絲及分生孢子做成臨時玻片[4]，觀察病原菌的菌絲、分生孢子的形態(tài)。

1.2.2 致病性測定 采用菌絲塊活體接種。取生長健壯的檀香幼苗，用75%酒精消毒，再用無菌水沖洗2～3次，用打孔器（d=6 mm）打取已經(jīng)活化好的供試菌株，用滅菌的接種環(huán)將菌絲塊移至葉片上，使用空白瓊脂塊作為對照。放入人工氣候培養(yǎng)箱中，并套上保鮮袋保濕培養(yǎng)。每株檀香幼苗接種4片葉片，共設5個重復。接種后24 h移去菌餅，連續(xù)觀察接種葉片發(fā)病情況，并將發(fā)病部位進行再次分離，觀察是否與接種菌一致。

1.2.3 病原菌DNA提取及rDNA-ITS擴增 將病原菌轉入新鮮的培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)箱中活化5 d后，刮取菌絲于離心管中，使用天根快速提取試劑盒提取病原菌的總DNA[5]。采用真菌通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）擴增DNA。PCR反應體系（25 μL）：引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，Taq酶0.25 μL，Mix 12.5 μL，dNTPs 1 μL，ddH2O 8.25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存[6]。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收純化與測序 使用H.Q.&.Q凝膠回收試劑盒對PCR擴增后的產(chǎn)物進行回收與純化[7]。將回收后的產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行DNA 測序。將測序結果與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫中的相關序列進行同源性比較。并用neighbor-joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 病原菌生物學特性研究

（1）不同溫度對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響。將菌絲塊（d=6 mm）接種于新鮮的PDA平板上，分別放入溫度為4、10、15、20、25、30、35、40 ℃的培養(yǎng)箱中，每種處理設置5個重復。培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。培養(yǎng)12 d后，在菌落表面加入15 mL無菌水，用兩層紗布過濾后得分生孢子懸浮液，離心后去上清液，用血球計數(shù)板將濃度調(diào)節(jié)至1×106個/mL[8]。取180 μL懸浮液于凹槽玻片中，再分別放置于以上8種溫度處理的培養(yǎng)箱中，保濕培養(yǎng)。每個處理設置5個凹槽玻片。15 h后統(tǒng)計分生孢子萌發(fā)率（%）[9]。

（2）不同pH對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0[10]（用pH計進行檢測）。將菌絲塊（d=6 mm）分別接種于以上不同pH值的培養(yǎng)皿中。每種處理設置5個重復。培養(yǎng)5 d后，分別測量菌落直徑。分生孢子懸浮液制備方法同1.2.1，用血球計數(shù)板調(diào)節(jié)懸浮液的濃度至1×106個/mL。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將分生孢子懸浮液pH值調(diào)節(jié)至3.0～11.0。分別取180 μL孢子懸浮液滴入凹槽玻片內(nèi)，每種處理設置5個玻片。在28℃條件下連續(xù)培養(yǎng)15 h后分別統(tǒng)計分生孢子的萌發(fā)率（%）。

（3）不同光照對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響。將菌絲塊（d=6 mm）接種于PDA平板中。將接種后的平板分別放入連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h光暗交替的人工氣候培養(yǎng)箱中，每種處理設置5皿。在28 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。分生孢子懸浮液制備方法同1.2.1，將分生孢子懸浮液濃度調(diào)至1×106個/mL。分別取180 μL配好的孢子懸浮液滴入凹槽玻片內(nèi)，將其放入連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、1 h光暗交替的培養(yǎng)箱內(nèi)，在28 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng)15 h后統(tǒng)計分生孢子的萌發(fā)率（%）。每種條件處理5次重復。

（4）不同碳源對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響。不同碳源設為：半乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、果糖、乳糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖，以不加任何碳源作為對照（CK），將菌絲塊（d=6 mm）接種于以上含有不同碳源的PDA培養(yǎng)基中。每種處理設置5皿。在28 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。分生孢子懸浮液制備方法同1.2.1。分別稱取半乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、果糖、乳糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖配制成1%的溶液，分別加入孢子懸浮液。再將分生孢子懸浮液濃度調(diào)至1×106個/mL。分別取180 μL配好的孢子懸浮液滴入凹槽玻片內(nèi)，在28 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng)15 h后統(tǒng)計分生孢子的萌發(fā)率（%）。

（5）不同氮源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響。使用查比克培養(yǎng)基，以不加任何氮源的查比克培養(yǎng)基為對照，用等質(zhì)量氮元素的蛋白胨、酵母膏浸粉、尿素、甘氨酸、硫酸銨、天冬氨酸、氯化銨代替其中的硝酸鉀，配成含有不同氮源的液體培養(yǎng)基。在各個不同氮源的100 mL培養(yǎng)液中各接入2塊菌絲塊（d=6 mm），每種做5個重復。在25 ℃、120 r/min恒溫搖床條件下震蕩培養(yǎng)。5 d后過濾出菌絲，置于烘箱中烘至衡重，用電子天平稱量菌絲干重（電子天平精度精確到0.000 1 g）。用血球計數(shù)板測量菌株在不同碳源濾液中的分生孢子濃度。8 d后測量產(chǎn)孢量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件分析溫度、pH值、光照條件以及不同碳源、氮源對病原菌菌絲生長以及分生孢子萌發(fā)的影響。用最小顯著差數(shù)法（LSD）比較不同條件下的差異顯著性（p=0.05）[11]。同時用Excel針對SPSS軟件方差分析的結果作圖。并標注出正負偏差。

2 結果與分析

2.1 檀香炭疽病林間癥狀

檀香炭疽病多發(fā)于土壤瘠薄，排水不良，濕度過大及植株長勢衰弱的林地。在8月上旬～11月上旬為該病高發(fā)期。感病初期葉片邊緣或中心出現(xiàn)淺褐色的病斑，隨著病斑不斷擴大，病斑處呈灰褐色，且長滿黑色的小點，為病原菌的分生孢子盤，病健交界處呈深紫褐色。最后病斑處穿孔。病斑多半從葉片尖端和邊緣開始，逐漸擴大，呈圓形、半圓形或呈不規(guī)則狀（圖1）。

2.2 病原菌形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀觀察

該菌菌落在PDA上呈圓形，邊緣整齊。菌絲最初為白色，菌落中心逐漸變成淺灰色至深灰色，外緣有一圈白色菌絲，菌落背面最后變成墨綠色，菌絲有隔膜大多在基部分支。培養(yǎng)8 d后，菌落上產(chǎn)生淺橘紅色的分生孢子團。分生孢子直、圓柱狀、兩端鈍圓、單胞、無色[12]，大小為10～20 μm×3.5～6.0 μm（圖2）。分生孢子附著胞褐色、為近圓形、矩圓形和不規(guī)則形。其形態(tài)特征與培養(yǎng)性狀與劉威[13]對茶樹炭疽菌（C. fructicola）的研究結果相似。記錄為SA-2。

2.3 致病性測定

將供試菌株接種到健康的檀香植株上，3 d后接種部位開始產(chǎn)生淺褐色的病斑，接種5 d后病斑進一步擴大，且病健交界處呈深紫褐色，病斑處出現(xiàn)破損，接種8 d后病健交界處紫色加深，病斑處葉片扭曲。且發(fā)病癥狀與林間的發(fā)病癥狀相同。對照組沒有發(fā)病。根據(jù)科赫氏法則，將接種后的病葉采回實驗室進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)與接種所用的菌株一致，則證明接種所用菌株即為SA-2（C. fructicola）（圖3）。

2.4 病原菌DNA的提取及rDNA-ITS的擴增結果

提取病原菌DNA后，使用引物ITS4和ITS5進行PCR擴增，可以擴增出約530 bp的DNA片段，經(jīng)切膠回收純化后，測序結果表明其rDNA-ITS基因序列長度為527 bp，將其與NCBI中GenBank里其他的序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該病原菌與C. fructicola（登錄號為KC702988.1）同源性最高，為99%，同時構建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4，結合對該菌的形態(tài)學鑒定，進一步從分子水平上鑒定該菌為C. fructicola。

2.5 檀香炭疽病原菌C. fructicola生物學特性研究

2.5.1 不同溫度對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

研究結果表明（圖5-A），在不同的溫度條件下，C. fructicola菌落直徑存在顯著性差異。該病原菌在4、40 ℃時明顯受到抑制，均不能生長。在10～35 ℃范圍內(nèi)均適合該菌生長，且30 ℃為該菌的最適生長溫度。菌落直徑達6.85 cm。其次為25 ℃，菌落直徑達6.45 cm。

圖5-B結果表明，C. fructicola分生孢子在10～35 ℃范圍內(nèi)均能萌發(fā)，且具有顯著性差異。其最適萌發(fā)溫度為30 ℃，萌發(fā)率高達84.5%，其次是25、20 ℃，萌發(fā)率達74.3%、58.2%，其余溫度下，孢子萌發(fā)率均不足50%。

2.5.2 不同pH對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

圖6-A結果表明，在不同pH值條件下，C.fructicola菌絲生長具有顯著性差異，pH3.0時，培養(yǎng)基不能凝固，因此不做菌落直徑測量。菌絲在pH4.0～11.0條件下均能生長，該病原菌的最適生長pH值為6.0，菌落直徑達6.92 cm。其次是pH值為5.0、7.0，菌落直徑分別為6.50、6.45 cm，之間不存在顯著性差異。pH值設為11.0時，菌絲生長受到明顯的抑制，菌落直徑僅達5.35 cm。由此可知該菌適宜在偏酸性環(huán)境下生長。

圖6-B結果表明，C. fructicola在pH4.0～11.0范圍內(nèi)均能萌發(fā)，在pH=5.0時萌發(fā)率高達94.7%，其次是pH=6.0、7.0，分生孢子萌發(fā)率達85.7%、65.7%，其余pH值條件下，分生孢子萌發(fā)率均低于60%，在pH11.0時，分生孢子萌發(fā)率受到明顯的抑制，只達25.5%，由此可知C. fructicola適宜生長在偏酸性環(huán)境中。

2.5.3 不同光照對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

圖7-A結果表明，C. fructicola在連續(xù)光照條件下和連續(xù)黑暗條件下菌絲生長存在顯著性差異，該病原菌最適宜在連續(xù)光照條件下生長，菌落直徑達6.38 cm，黑暗條件和12 h光暗交替分別為6.17、6.15 cm，無顯著性差異。由此可知，連續(xù)光照條件更適宜菌絲生長。

圖7-B結果表明，黑暗條件最適宜C. fructicola分生孢子的萌發(fā)，萌發(fā)率高達96.4%。連續(xù)黑暗條件與連續(xù)光照條件分生孢子萌發(fā)率存在顯著性差異。光照條件和12 h光暗交替條件下，分生孢子萌發(fā)率分別達73.5%、71.5%，無顯著性差異。由此可知，連續(xù)黑暗更適宜分生孢子的萌發(fā)。

2.5.4 不同碳源對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響 由圖8-A結果可知，不同的碳源條件下該病原菌均能生長，但存在著顯著性差異。該病原菌在蔗糖為碳源條件下，菌絲生長最快，第5天時達到7.91 cm；其次為可溶性淀粉、果糖、葡萄糖，菌落直徑分別為7.17、6.86、6.74 cm。該病原菌對阿拉伯糖的利用率最低，菌落直徑僅為5.33 cm，在對照組（未加入任何碳源）中，菌絲也能生長，但菌落直徑僅有3.19 cm。

由圖8-B結果可知，不同的碳源條件下該病原菌的分生孢子均能萌發(fā)，但存在著顯著性差異。在蔗糖為碳源條件下，孢子萌發(fā)率最高，達到88%；其次為果糖、可溶性淀粉、葡萄糖，萌發(fā)率分別為84.7%、84.1%、78.5%。乳糖和阿拉伯糖最不利于該病原菌產(chǎn)生分生孢子。

2.5.5 不同氮源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 圖9-A結果表明，該病原菌在不同的氮源條件下均能生長，具有顯著性差異。在不加任何氮源的查比克培養(yǎng)液中也能生長，但是長勢較差。由圖9可知該病原菌對蛋白胨的利用率較高，以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)液中菌絲干重高達1.06 g，其次為酵母膏浸粉和硫酸銨為氮源時，該病原菌菌絲干重分別為0.89、0.92 g。該病原菌對甘氨酸的利用率最低，菌絲干重為0.78 g。

圖9-B結果表明，該病原菌在以下7種不同氮源條件下均能產(chǎn)孢，但產(chǎn)孢量具有顯著性差異。以尿素為氮源的培養(yǎng)液更適于產(chǎn)孢，分生孢子濃度高達10.47×106個/mL，其次是以酵母膏浸粉和蛋白胨為氮源時，分生孢子濃度分別為10.06×106個/mL、9.43×106個/mL。在以天冬氨酸為氮源時，其產(chǎn)孢量最少，孢子濃度為4.50×106個/mL。但均高于無氮源條件下的產(chǎn)孢量。

3 討論與結論

Sutton[14-15]在von Arx[16]炭疽屬分類系統(tǒng)的基礎上對其劃分依據(jù)做了修正，Sutton分類系統(tǒng)對炭疽屬的劃分依據(jù)是通過對純培養(yǎng)物的形態(tài)學、培養(yǎng)學和寄主范圍的研究來確定，尤其是依據(jù)分生孢子和分生孢子附著胞的特征來確定。但是真菌的某些形態(tài)特征會因環(huán)境條件的改變而改變，因而僅靠形態(tài)特征來鑒定真菌種類是不準確的[17-18]。因此，筆者依據(jù)培養(yǎng)性狀、形態(tài)學鑒定以及rDNA-ITS序列分析，將引起檀香炭疽病的病原鑒定為C. fructicola。本研究與張艷敏[19]對冬青炭疽菌（C. fructicola）和Prihastuti H[20]對泰國北部咖啡豆炭疽菌（C. fructicola）的研究結果基本一致。但張艷敏在“云南省部分觀賞植物葉面病原真菌的多樣性調(diào)查和系統(tǒng)學研究”一文中提到未在平板上觀察到C. fructicola產(chǎn)生分生孢子，且未進行分生孢子附著胞的觀察。本研究中筆者在培養(yǎng)8 d的培養(yǎng)基上觀察到橘紅色的分生孢子，并對分生孢子進行培養(yǎng)產(chǎn)生附著胞后在數(shù)碼顯微鏡下拍照。

研究病原菌的生物學特性對檀香炭疽病的早期診斷與防治、病害的預測預報具有著重大的意義。但針對C. fructicola生物學特性的研究國內(nèi)外還未見系統(tǒng)報道。筆者研究了不同溫度、pH值、光照、碳源、氮源對C. fructicola菌絲生長以及分生孢子萌發(fā)的影響，結果表明適宜該菌生長的溫度范圍為10～35 ℃，最適生長溫度為30 ℃，這與炭疽病的高發(fā)期在8～11月高溫高濕條件下相吻合，分生孢子可在10～35 ℃萌發(fā)，最適萌發(fā)溫度為30 ℃；菌絲在pH4.0～11.0條件下均能生長，該病原菌的最適生長pH值為6.0，分生孢子在pH值為4.0～11.0范圍內(nèi)均能萌發(fā)，在pH值為5.0時萌發(fā)率最高；連續(xù)光照條件更適宜菌絲生長，連續(xù)黑暗更適宜分生孢子的萌發(fā)；在不同的碳源條件下，該菌對蔗糖的利用率最高；在不同氮源條件下，該病原菌在以蛋白胨、酵母膏浸粉、硫酸銨為氮源的培養(yǎng)液中生長時，長勢較好，但尿素作為氮源時更利于該病原菌產(chǎn)孢。從對C. fructicola生物學特性室內(nèi)測定結果可推測，林間溫度的變化與檀香炭疽病的流行有十分密切的關系。高溫且連續(xù)陰雨的氣候條件有利于炭疽病的流行蔓延。因此，在高溫雨季的病害盛發(fā)初期，應加強對病害的預防工作。通過對檀香炭疽病原的生物學特性研究，對今后深入研究和控制該病害具有一定的參考意義。

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